一、 摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定陈醋中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。色谱条件：C₁₈色谱柱（4.6×250mm，5μm），采用等度洗脱，流速为0.8mL/min，柱温为35℃，进样量为50μL，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为218nm。实验结果：DON峰的理论塔板数为14914，对称因子为1.12；连续进样7针重复性测试中，DON峰保留时间的RSD为0.068%，峰面积的RSD为0.755%；DON的仪器检出限为10.757ng/mL，仪器定量限为35.857ng/mL；DON在测定浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R²＞0.999；样品中DON的含量为46.29μg/kg，其加标回收率为92.0%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《GB/T 5009.111-2016 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量测定的需求。

二、 背景

单端孢霉烯族毒素是粮食中最常见的一类污染性霉菌毒素，由镰刀菌产生，包括T-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)、玉米赤霉烯酮(Zearalmone)、伏马菌素(Fumonisin)、镰刀菌烯酮.X(Fusarenon.X，FX)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等，可对人、畜产生广泛的毒性效应，如食欲降低、体重减轻、代谢紊乱等。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（以下简称DON）又称为呕吐毒素，主要由某些镰刀菌产生，包括：禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌和雪腐镰刀菌等；在体内可能有一定的蓄积，但无特殊的靶器官，具有很强的细胞毒性。人畜摄入了被DON污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。

三、 实验过程

1 范围

适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的含量测定。

2 原理

试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）用水提取，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱-二极管阵列检测器测定，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2甲醇：色谱纯；

3.3乙腈：色谱纯；

3.4聚乙二醇：分析纯；

3.5 氯化钠：分析纯；

3.6 磷酸氢二钠：分析纯；

3.7 磷酸二氢钾：分析纯；

3.8 氯化钾：分析纯；

3.9 盐酸：分析纯；

3.10 磷酸盐缓冲溶液（PBS）：分别称取0.80g氯化钠（3.5）、0.12g磷酸氢二钠（3.6）、0.02g磷酸二氢钾（3.7）和0.02g氯化钾（3.8），置于100mL容量瓶中，用90mL水（3.1）溶解，用盐酸（3.9）调节pH至7.0，用水（3.1）定容至刻度线，0.22μm滤膜（4.6）过滤；

3.11 DON标准溶液：CAS号为51481-10-8，浓度为100µg/mL；

3.12 样品：陈醋，市售。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 DAD二极管阵列检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 分析天平：精确到0.0001g；

4.3 pH计：精确到0.01；

4.4 涡旋振荡器；

4.5 超声波清洗机；

4.6 微孔滤膜：0.22μm，有机相；

4.7 移液器：100μL，1000μL；

4.8 容量瓶：50mL、100mL，棕色；

4.9 离心管：10mL；

4.10 DON免疫亲和柱：柱容量≥1000ng；

4.11 氮吹仪；

4.12 氮气钢瓶；

4.13 离心机。

5 测定步骤

5.1 DON系列标准工作液的配制

准确吸取一定量的DON标准溶液（3.11），用流动相（5.3 b））逐级稀释成DON浓度分别为100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和5000ng/mL的系列标准工作液，4℃保存，有效期7d。

5.2 样品前处理

5.2.1 测试液的配制

（1）空白溶液：称取5g聚乙二醇（3.4），置于50mL容量瓶内，用水（3.1）定容至刻度线，混匀，超声处理20min，4000r/min下离心10min，取上清液，待净化；

（2）供试品溶液：称取样品（3.12）25g（精确至0.1g），置于50mL容量瓶内，加入5g聚乙二醇（3.4），用水（3.1）定容至刻度线，混匀，超声处理20min，4000r/min下离心10min，取上清液，待净化；

（3）供试品加标溶液：称取样品（3.12）25g（精确至0.1g），置于50mL容量瓶内，加入5g聚乙二醇（3.4）、DON标准溶液（3.11）50μL，用水（3.1）定容至刻度线，混匀，超声处理20min，4000r/min下离心10min，取上清液，待净化。

5.2.2净化

事先将低温下保存的免疫亲和柱（4.10）恢复至室温。待免疫亲和柱内原有液体流尽后，准确移取2.0mL待净化样液（5.2.1）至免疫亲和柱中，调节下滴速度，控制测试液以每秒1滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入免疫亲和柱中。用5mL PBS缓冲盐溶液（3.10）和5mL水（3.1）先后淋洗免疫亲和柱，流速约为每秒1~2滴，直至空气进入免疫亲和柱，弃去全部流出液，抽干小柱。

5.2.3洗脱

准确加入2mL甲醇（3.2）洗脱上述免疫亲和柱（5.2.2），控制下滴速度为每秒1滴，收集全部洗脱液至10mL离心管（4.9）中，在50℃下用氮气（4.12）缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0mL初始流动相（5.3 b）），涡旋30s溶解残留物，过0.22μm微孔滤膜（4.6），取续滤液待上机测定。

5.3色谱条件

a）色谱柱：C₁₈色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：甲醇（3.2）：水（3.1）=20:80；

c）流速：0.8mL/min；

d）进样量：50μL；

e）柱温：35℃；

f）检测器及检测波长：检测器为二极管阵列测器，检测波长为218nm。

6 结果

6.1重复性测试

按照上述色谱条件（5.3）进行采集，DON标准溶液（浓度为500ng/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

图1 DON标准溶液（浓度为500ng/mL）的色谱图

表1 DON标准溶液（浓度为500ng/mL）色谱图积分结果

由表1中数据可知，DON峰的理论塔板数为14914，对称因子为1.12，具有良好的峰形。

将DON标准溶液（浓度为500ng/mL）连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

 

图2 DON标准溶液（浓度为500ng/mL）连续进样7针叠加的色谱图

表2 DON标准溶液（浓度为500ng/mL）连续进样7针重复性数据统计

由表2中数据可知，将DON标准溶液（浓度为500ng/mL）连续进样7针进行重复性测试，DON峰保留时间的RSD为0.068%，峰面积的RSD为0.755%，具有良好的定性定量重复性。

6.2仪器灵敏度测试

灵敏度测试的色谱图如图3所示，计算结果见表3。

 

图3 仪器灵敏度的色谱图

表3 仪器灵敏度测试数据

由表3中数据可知，DON的仪器检出限为10.757ng/mL，仪器定量限为35.857ng/mL。

6.3含量测定

6.3.1 校准曲线

按照色谱条件（5.3），将DON系列标准工作液（5.1）上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数如图4所示。由图4可知，DON在测定浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R²＞0.999。

 

图4 DON的校准曲线

DON系列标准工作液叠加的色谱图如图5所示。

 

图5 DON系列标准工作液叠加的色谱图

6.3.2 样品测定

按照色谱条件（5.3），对空白溶液、供试品溶液、供试品加标溶液进行采集，依据公式（1）计算DON的含量。

式中：ω----为试样中DON的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

C----为通过校准曲线得到的测试液中DON的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V----为试样的定容体积，单位为毫升（mL）；

N----为试样的稀释倍数；

m----为试样的质量，单位为克（g）。

空白溶液、供试品溶液、供试品加标溶液的色谱图如图6~图8所示。

 

由公式（1）计算供试品中DON的含量，其DON的含量为46.29μg/kg，加标回收率为92.0%。

7 结论

本文使用Wooking K2025高效液相色谱仪测定陈醋中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。实验使用甲醇-水（20:80）为流动相，采用反相色谱体系，实验结果表明：DON峰的理论塔板数为14914，对称因子为1.12，具有良好的峰形；连续进样7针重复性测试中，DON峰保留时间的RSD为0.068%，峰面积的RSD为0.755%，具有良好的定性定量重复性；DON的仪器检出限为10.757ng/mL，仪器定量限为35.857ng/mL；DON在测定浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R²＞0.999；样品中DON的含量为46.29μg/kg，其加标回收率为92.0%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《GB/T 5009.111-2016 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量测定的需求。