花生是重要的粮油兼用豆科作物。花生易受黄曲霉毒素污染,且生产上结瘤少、固氮效率低,成为花生产业保安全与减肥增产面临的两大难题。团队前期发明了ARC菌剂,在全国花生主产区大田生产中应用,取得了土壤源头阻控黄曲霉产毒菌和促进高效结瘤固氮并显著增产的效果,为花生产业绿色健康发展提供技术支撑。为了研究揭示ARC菌剂作用机理,本研究分离鉴定并比较了花生土著根瘤菌结瘤固氮能力受ARC菌剂的调控效应,研究了ARC菌剂与根瘤菌协同阻控黄曲霉菌效应,并揭示了ARC菌剂耦合效应对花生质量安全的影响,为ARC菌剂作用机理奠定了基础。主要创新结果如下: (1)ARC菌剂诱导的花生根瘤菌分离与鉴定 从12个大田试验示范区采集ARC菌剂处理的花生根瘤样本,成功分离获得24株根瘤菌,采用16S r DNA系统发育树鉴定,24株均为慢生根瘤菌。通过每个示范区选一株菌株的原则并结合系统进化树分析,筛选出12株根瘤菌进行温室盆栽试验,研究比较ARC菌剂对根瘤菌不同菌株调控结瘤固氮作用的差异。研究结果显示,ARC菌剂处理对这12株根瘤菌的瘤数、瘤重以及每克固氮酶活的调控作用存在显著差异:在每克固氮酶活上,根瘤菌提升幅度为0-248.4%,以根瘤菌PGDGZ-23-1受ARC菌剂调控最显著;在瘤数上,提升幅度为14.5%-107.5%,根瘤菌PJSSY-23-4受ARC菌剂调控最显著;在瘤重上,提升幅度为8%-80.3%,根瘤菌PJSSY-23-4受ARC菌剂调控最显著。ARC菌剂处理也对这12株根瘤菌促生长的调控作用存在显著差异:在SPDA上,根瘤菌提升幅度为0-20.2%;在地上部鲜重上,提升幅度为4.2%-33.3%;在根重上,提升幅度为0.3%-106%;在根长上,提升幅度为7.2%-37.5%;在株高上,提升幅度为0-19.5%。ARC菌剂对根瘤菌调控作用的差异性表明ARC菌剂对土著根瘤菌的调控有选择性。根据综合指标评价,根瘤菌PGDGZ-23-1受ARC菌剂调控最显著,为后续ARC菌剂机制机理研究提供了材料。 (2)ARC菌剂和根瘤菌协同阻控黄曲霉菌效应研究 通过平板对扣试验,研究了根瘤菌挥发性物质与ARC菌剂协同处理,对黄曲霉生长与产孢的抑制作用,结果表明根瘤菌PGDGZ-23-1的挥发性物质与ARC协同处理对黄曲霉生长与产孢的抑制作用最为显著。因此选择根瘤菌PGDGZ-23-1进一步开展与ARC菌剂协同阻控黄曲霉的研究。根瘤菌在含有黄曲霉代谢物的培养基中生长试验表明,黄曲霉代谢产物对根瘤菌增殖有抑制作用,且存在浓度依赖性,表明黄曲霉减少有利于根瘤菌增殖。根瘤菌、ARC菌剂以及黄曲霉共培养试验结果显示,根瘤菌、ARC菌剂以及二者协同处理对黄曲霉菌的生长抑制率分别为34.2%和80.7%和91.7%,对黄曲霉毒素B1(AFB1)的抑制率分别为52%、97%和96%,表明根瘤菌和ARC菌剂均对黄曲霉生长和产毒有显著抑制作用,ARC菌剂的抑制作用显著高于根瘤菌,但二者协同效应仅限于对黄曲霉的生长。该现象在花生侵染实验中表现一致。通过扫描电镜图以及实时荧光定量PCR结果显示,根瘤菌、ARC菌剂及其二者协同处理均破坏黄曲霉菌丝形态且显著下调黄曲霉产毒基因(afl D、afl R、afl G、afl O)的表达水平,其中二者协同处理对菌丝结构的损伤更为严重,且对黄曲霉产毒基因afl R的抑制作用最为显著。 (3)ARC菌剂和根瘤菌协同对花生提质固氮耦合效应的评估 通过大田试验,测定花生生长指标、固氮酶活、单株果数果重以及花生品质,探究ARC菌剂和根瘤菌协同作用对花生提质增产的影响。试验结果显示,根瘤菌PGDGZ-23-1与ARC菌剂的协同处理显著促进了花生生长、固氮及单株生产力,具体表现为地上部鲜重增加79.6%、单株固氮酶活性增加215.8%、单株果数与果重分别提高102.6%和88%。相较于单接ARC菌剂,双接ARC菌剂和根瘤菌PGDGZ-23-1增加了12.9%的地上部鲜重,提高了11.1%的每株固氮酶活性,同时也增加了33.9%的单株果重,表明ARC菌剂和根瘤菌协同作用可进一步促进花生增产。在花生品质上,协同处理提高了0.5%的蛋白质含量,显著提高了花生天冬氨酸、谷氨酸以及苯丙氨酸等风味氨基酸和苏氨酸、蛋氨酸以及缬氨酸等必需氨基酸的含量。相较于单接ARC菌剂,协同处理提高了7.9%白藜芦醇的含量,表明ARC菌剂和根瘤菌协同处理能进一步花生白藜芦醇含量。综上结果表明,双接ARC菌剂和根瘤菌能提高花生产量和品质,且对花生产量和白藜芦醇的提升有协同增效。 综上所述,本研究分离出的根瘤菌在促生长和固氮能力上均受ARC菌剂正向调控,且调控作用具有差异性;ARC菌剂与根瘤菌协同处理对黄曲霉菌有阻控作用,主要表现在对黄曲霉菌的生长抑制、菌丝的破坏以及产毒基因afl R的调控;大田试验表明ARC菌剂和根瘤菌协同作用能提高花生产量和品质,且对花生产量和白藜芦醇的提升有协同增效。本研究为ARC菌剂机制机理研究提供菌株材料和理论基础。