应用说明

人促红细胞生成素（EPO）-蛋白，CZE

重组人促红细胞生成素在悟空毛细管电泳平台上的分析

重组促红细胞生成素用于治疗贫血等疾病，但因在耐力运动中作为血液兴奋剂使用而臭名昭著。使用Peregrine高效毛细管电泳系统和悟空专有LFII^®技术，分析获得糖型指纹，提供了峰迁移率（<2%RSD）和峰面积（<2%RSD）方面的高质量可重复数据。这可能被用来识别个别供应商的配方和滥用。

简介

促红细胞生成素（EPO）是一种糖蛋白激素，其参与刺激新的红细胞。重组人促红细胞生成素是治疗某些类型贫血的标准物质。

EPO分子量约为30.6kDa，pI约为4.4，大约40%的成熟分子的分子质量是由碳水化合物组成的。促红细胞生成素的糖基化对其生物活性至关重要。它有4个糖基化位点，3个N-键和1个O-键，其含有最多14个唾液酸残基。因此，EPO是在结构、组成和异构体电荷上不同的糖类混合物。这些糖类种群既具有种特异性又具有组织特异性。

重组促红细胞生成素（rEPO）自1988年开始作为药物应用。现已确定这些重组形式的电泳图谱不同于天然的、纯化的尿促红细胞生成素。由于运动员非法使用EPO以提高其在耐力运动中的表现，奥林匹克委员会在1989年禁止滥用EPO。兴奋剂检查可能通过监测某些血液学参数以间接的方式进行。然而，首选是明确确认其在生理流体中的存在。目前，已建立的毛细管电泳（CE）方法允许8种EPO亚型的基线分辨率，为欧洲药典（EurPh）提供了方法。

本报告展示了基于HPCE Peregrine的LFII^®技术使用毛细管区带电泳（CZE）对EPO唾液酸的分析。分离参数和缓冲液是基于欧洲药典建立的方法，同时改进了分离和分析时间。

材料和方法

促红细胞生成素亚型的分离是在悟空HPCE Peregrine平台上进行的。在内径为50μm、分离长度72cm、总长度为84cm的裸石英毛细管中进行。毛细管最初的调节使用专有方法，使用分离缓冲液冲洗30min。毛细管在20kV电压下保持15min。在两次运行之间，用专用冲洗液冲洗毛细管5min，再用运行缓冲液冲洗20min，随后进行自动欧姆定律绘图，电压在18kV保持15min。

冻干rEPO标准品的制备详见欧洲药典，同时也制备了分离缓冲液。注射前，样品用脱盐柱（穿孔）脱盐。所有样本均以1psi的流体动力注射15s，并运行15kV的电压。分离过程中，毛细管保持在35°C。检测在214nm处进行。

结果

用悟空HPCE Peregrine系统的等相位顶点算法（EVA）和通用分离变换（GST）算法快速有效地分离EPO糖类。GST是一种以自然方式组合来自512像素的数据方法，保留电泳峰形信息的同时使信噪比最大化。我们观察到，与单一电泳图相比，使用GST使信噪比增加了10倍。此外，吸光度A可直接从GST图的峰值高度V中读出，作为时间的函数t（A=0.434 V（t））。

EVA是一种先进的模式识别工具，最大限度地提高了系统的分辨率。EVA首先对电泳图进行分析，找出局部峰。这些首先用于执行顶点（确定波段的原点），然后产生信号输出。

欧洲药典标准EPO样品的原始电泳图和GST处理数据如图1所示。在每个峰之间以基线分辨率观察到9个亚型峰。相比之欧洲药典方法中的1h，此处样品的分离在45min内完成。在糖蛋白前面迁移的大前锋（图1A和图2）是溶剂前锋。

分析的重组EPO样品与欧洲药典相似，但与欧洲药典EPO标准不完全相同，糖型谱之间存在一定的差异。根据GST峰面积测定每种异构体的百分含量（表1），这些值与欧洲药典确定的范围一致。除了7亚型，所有的亚型都在范围之内。糖基化模式受样品中使用的特定细胞系的制备、可变培养条件及纯化方法的影响。

悟空HPCE Peregrine的LFII^®系统证明了9个亚型峰的重现性。基于峰迁移时间和峰面积，根据EVA计算数据重现性，如表2和表3所示。

结论

重组EPO糖型可以用悟空HPCE Peregrine LFII^®系统分析。该方法修改欧洲药典方案，提供类似或更好的结果与较短的毛细管条件和样品分析时间。根据已建立的欧洲药典方案，毛细管应在20kV电压下初步调节12h，而修改后的方案建议在20kV电压下调节15min。这使得同一天的分离具有可重复的结果；亚型1-9在10次运行中的峰移时间变化小于2%，亚型2-8的峰面积变化相同。

这种稳健的分析技术不仅用于兴奋剂控制方面，而且用于制药工业的重组人促红细胞生成素的质量控制及其类似物。新产品可以在质量和数量上与标准（欧洲药典）进行比较以寻找糖类含量的杂质及其变化。