免标记内成像法

应用说明：抗体

悟空HPCE-512毛细管电泳仪Peregrine I免标记分析免疫球蛋白G

摘要

采用悟空HPCE Peregrine I对几种哺乳动物血清IgG和市售对照标准IgG进行了分析，根据片段性、特异性和异质性评价IgG的稳定性。

观察到了碎片化模式和基线分辨的非糖基化重链峰，获得了良好的重现性数据（峰迁移时间RSD＜0.03%；定量RSD＜1%）。同时，也获得了非糖基化的准确定量，其含量达到总重链的9.6%。

引言

为了评估mAbs（重组单克隆抗体）作为生物制药产品的生物活性和安全性，对其分子和杂质进行表征是非常重要的。这不仅对评估潜在生物制药产品的适用性至关重要，而且对优化和质量保证/质量控制药物的生产工艺、储存条件和使用寿命也很重要。

在五种定义的抗体类别中，所有目前获得许可的单克隆抗体都属于免疫球蛋白G（IgG）类别，在治疗和免疫诊断领域都有应用。近年来，许多研究小组报道了用SDS-CGE（SDS毛细管凝胶电泳）系统进行mAbs的定性和定量分析。一些人报告了从单克隆抗体样本中检测到的片段，这些片段对应于抗体的H2 L、H2、HL、H和L部分。碎片化被认为是由于不完全组装、缺乏分子间二硫键和/或微生物污染引起的蛋白质分解所致。碎片化水平被用作衡量抗体稳定性的指标。用SDS-CGE研究了pH、温度和缓冲体系对破碎的影响。

本应用说明了悟空HPCE LFII^®（免标记内成像）技术与CE（毛细管电泳）联用如何评估IgG的裂解模式和翻译后修饰。同样的策略也可用于评估生物制药单克隆抗体的稳定性和有效性。

材料与方法

在还原和非还原条件下制备哺乳动物血清lgGs。用专有方法制备还原样品，并在95℃下孵育10min。在95℃下加热10min，将非变性样品破碎。还原对照标准IgG采用与上述相同的专有方法制备，并在95℃下加热5min。

毛细管电泳分离在内径为50μm，分离长度为20cm，总长度为32cm的裸石英毛细管中进行。所有血清IgG样品均在5kv下电动注射10s，18kV下分离25min。分离过程中，毛细管保持在22°C。检测波长为214nm。在实验开始和两次运行之间，使用专有方法对毛细管进行调节。在两次运行之间，用1M NaOH冲洗毛细管5min，然后用0.1M NaOH、0.1M HCl冲洗毛细管，每次运行缓冲液5min。调节后，进行缓冲液电导率检查。

使用悟空HPCE的等相位顶点算法（EVA）和广义分离变换（GST）算法进行分离分析。GST是一种以自然方式组合512像素的数据方法，该方法保留了电泳图的峰值形状信息，同时将信噪比最大化。与单次电泳相比，使用GST的信噪比通常会增加10倍。EVA是一种先进的模式识别工具，最大限度地提高了系统的分辨率。在EVA中，首先分析电泳图以找到局部峰。这些首先用于执行顶点（确定频带的原点），然后产生信号输出。

结果和讨论

在还原和非还原条件下分离出3种哺乳动物血清IgGs（牛、羊和兔）。在还原条件下，SDS蛋白复合物于95℃在还原剂存在时加热10min。这种处理打破了重链和轻链（分别为HC和LC）之间的共价二硫键，将IgG结构还原为两种分子量不同的物种。在非还原条件下，SDS蛋白复合物在没有还原剂的情况下于100℃加热10min，以促进IgG结构的裂解过程。

图1显示热处理后未还原牛血清IgG的EVA处理数据。观察到8种具有不同迁移时间的物种的剖面，其中LC和HC可以根据从还原IgG的GST剖面（未显示数据）获得的迁移时间信息识别得到。最后一个迁移峰被指定为整个IgG分子，其余峰被鉴定为2HC+1LC、2HC、1HC+1LC和样品中存在的低水平杂质。

在未还原的山羊和兔血清IgG中观察到相同的片段模式-包括整个IgG、2HC+1LC、2HC、1HC+1LC、HC/LC部分和低水平杂质（数据未显示）。每一部分的迁移时间在所检测的三种哺乳动物IgGs中各不相同。

图1  EVA处理的在非还原条件下用市售SDS凝胶缓冲液分离牛血清IgG的SDS-CGE数据。

鉴于SDS-CGE比传统SDS-PAGE具有更高的分辨率，因此可以通过基于质量的分离来检测IgG翻译后修饰的异质性。翻译后修饰的一个重要方面是糖基化。采用LFII^® SDS-CGE系统中的LFII^®分辨力可以通过非糖基化（NG-HC）和糖基化（HC）重链分子的基线分辨分离来证明。使用的样品是商业对照标准IgG，其中存在已知数量的非糖基化重链。图2显示了商业控制标准IgG的EVA处理数据，其中非糖基化重链是从糖基化重链基线解析的。

图2 变性条件下的商业控制标准，LC轻链，HC重链，NG-HC非糖基化重链的EVA处理数据

图3显示EVA处理变性条件下连续8次工业控制标准IgG数据的叠加。这8次运行的分析结果汇总在表1中。所有三种物种（轻链、非糖基化重链和糖基化重链）迁移的相对标准差（%RSD）均小于0.03%，而每种物种的定量（LC、%NG-HC和%HC）均小于1%RSD。通过再现性研究，可以清楚地证明LFII^®技术在分辨率和定量方面的精度。在定量分析的基础上，计算出样品中存在的非糖基化重链的百分比，该百分比为总重链的9.55%±0.007，而供应商的数字为9.5%。

图3 还原条件下连续运行8次的商业控制标准IgG的EVA处理数据叠加图

表1变性条件下分离的轻链、非糖基化重链和控制标准IgG重链的平均值、标准差、峰时相对标准差和相对定量。

轻链糖基化也可以用悟空HPCE的专有方法来观察。由于一些抗体样本的轻链峰上有一个“肩膀”，因此使用了一种替代的CGE方法，试图进一步解决这些样本中存在的任何潜在的糖型。毛细管的分离长度增加到40cm，以提高抗体糖基化和非糖基化轻链之间的分辨率（图4），并对缓冲体系进行了一些调整。

图4 用CGE分析抗体轻链上的糖基化

结论

本应用说明了如何使用悟空HPCE Peregrine I系统上的SDS-CGE，以快速、可重复的方式获得有关IgG样品稳定性、纯度和异质性的有价值的信息。观察到的片段化模式和基线分辨的非糖基化重链峰，具有良好的重现性（峰迁移时间<0.03%RSD；定量<1%RSD）。非糖基化产物的准确定量也达到了总重链的9.55%。同时，还可以观察到轻链糖基化。

将悟空HPCE的Peregrine I系统应用于生物制药产品的生产，可以作为评价潜在产品生物活性和安全性的有力工具。这些信息对生物制药产品的生产工艺、储存条件和使用寿命的优化和质量控制至关重要。

抗体-蛋白质，SDS-CGE

用悟空HPCE的Peregrine I高效毛细管电泳结合免标记内成像（LFII^®）技术分析免疫球蛋白G（IgG）。

准确鉴定免疫球蛋白是利用重组单克隆抗体（mAbs）作为治疗和诊断药物的关键。

用SDS-CGE在非还原和还原条件下分离IgG样品，可获得样品稳定性、纯度和非均质性等有价值的信息。

商业控制标准IgG的分析也清楚地表明了LFII^®用于HPCE Peregrine I系统定量的分辨率和准确性。除了糖基化重链和轻链的非糖基化重链的基线分辨率外，在连续8次运行之间获得了极好的重现性（峰迁移时间<0.03%RSD，相对定量<1%RSD）。

根据我们的分析，非糖基化重链的相对控制量估计为总重链的9.55±0.07%。

这种精密度、易用性和仪器的多功能性使HPCE Peregrine I和LFII^®技术成为抗体分析的理想解决方案。