免标记内成像法

应用说明：氨基酸

使用悟空HPCE-512毛细管电泳仪免标记内成像技术分析氨基酸标准物

摘要

使用配备间接紫外检测器的毛细管电泳分析9种氨基酸。与HPLC相比，这是一种快速便捷的氨基酸分析方法。采用反极性模式，样品由阴极注入并朝着位于阳极的检测器电泳。

引言

采用吸收紫外光的缓冲液，悟空HPCE核心免标记内成像（LFII^®）技术被用于间接紫外检测。当非紫外吸收的分析物通过检测窗口时光得以传输。间接紫外可被用于分析常规LFII^®方法无法获得的物质，例如：碳水化合物、脂质和糖，这些物质在悟空HPCE的LFII^®技术支持的200~300nm范围内吸收很少。

在这个例子中，使用悟空专有的LFII^®技术对氨基酸混合液进行研究，并使用高pH缓冲液保证氨基酸残基完全离子化。将季铵盐添加到电解质中以反转EOF的方向，使得阴离子朝正极方向共同迁移。

使用LFII^®的间接紫外检测器使9种氨基酸可视化（图 1）。分析了混合物中有紫外吸收的酪氨酸和色氨酸，表明此方法可同时检测含发色基团和不含发色基团的氨基酸。

图1  9种氨基酸的结构（依次为天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酸盐、亮氨酸、色氨酸）

使用间接紫外检测器时，添加的背景电解质（BGE，正丁基缩水甘油醚）或添加剂对于紫外吸收至关重要。不仅pH值和存在的发色团波长很重要，添加剂相对于目标分析物的迁移率以及添加到缓冲液中的浓度也十分重要。

由于缓冲液中添加了紫外吸收添加剂，会产生大电流，所以选择50μm内径的毛细管。充分的毛细管预处理对于确保稳定的涂层和反向EOF的产生至关重要。

材料与方法

本报告中的数据来源于Peregrine I HPCE，所有检测均在254nm下进行。9种氨基酸的分离在内径为50μm，总长度为82.1cm，有效分离长度为69.9cm的裸露熔融石英毛细管中进行。Peregrine I的Peltier冷却系统温度设置为18℃。氨基酸溶液由粉末通过蒸馏水稀释而得，浓度为150μg/mL，用于方法开发和重现性研究。

所有样品在反极性模式下以1.0psi流体力学注射5s。电泳在专用缓冲系统（pH 12.0）中进行。新毛细管通过在30psi压力下，用缓冲液冲洗15min来调节。

结果与讨论

配有LFII^®检测器的Peregrine I HPCE系统用于9种氨基酸残基的分析。采用悟空HPCE的等相顶点化算法（EVA）和广义分离变换（GST）算法对分离物进行分析。GST是一种以自然方式组合来自512像素的数据方法，保留电泳峰形信息的同时使信噪比最大化。通常情况下，与单个电泳图相比，使用GST观察到的信噪比增加了10倍。EVA是一种先进的模式识别工具，可最大化系统分辨率。在EVA中，首先对电泳图进行分析以找到局部峰。这些首先用于顶点化（确定波段的原点），然后产生信号输出。

EVA是一种先进的模式识别工具，可最大化系统分辨率，使用顶点确定波段原点从而产生信号输出，将定量信息转化为峰高而不是峰面积。本报告中引用的结果均基于GST和EVA分析数据。

使用GST处理数据，解析9种氨基酸残基并进行基线分辨率分析。Figure 2和3分别显示了有代表性的GST和EVA分析。EVA处理软件经过改进后用于将GST处理得到的负峰描绘为正峰。

图2  9种氨基酸的GST分离图谱，分析物为：（1）天冬氨酸（2）谷氨酸（3）半胱氨酸（4）酪氨酸（5）天冬酰胺（6）脯氨酸（7）谷氨酸盐（8）亮氨酸（9）色氨酸（4和9都包含发色团）。

图3  9种氨基酸的EVA分离图谱，分析物为：（1）天冬氨酸（2）谷氨酸（3）半胱氨酸（4）酪氨酸（5）天冬酰胺（6）脯氨酸（7）谷氨酸盐（8）亮氨酸（9）色氨酸。

重现性研究采用压力进样，9种氨基酸混合物的浓度为150μg/mL。表 1和2列出了重现性研究中天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸GST和EVA的出峰数据。

检出限与定量限

1.压力进样

在1psi压力条件下注射5s，根据表3中列出的物质，配制一系列10mM~0.039mM浓度梯度的溶液，表3中列出了每种分析物。对于每种分析物（除赖氨酸外），根据1.25mM~0.039mM之间的5个点计算LOD和LOQ。

LOD范围为0.037 ~0.45mM，LOQ范围为0.01~1.38mM。赖氨酸在7psi压力下进样3s，采用不同的紫外吸收缓冲液，计算得到LOD为0.06μM，LOQ为0.2μM。

2.电动堆积进样

堆积过程通常用于将长进样区中存在的低浓度分析物富集到一个短区域（堆积）中。堆积的分析物随后被分离并检测各个区域。因此，堆积可以提供更好的分离效率和检测灵敏度。

图4表明了分析物为水溶液时进样电压和时间的线性关系。当分析物为水溶液时，10kV进样60s观测到的峰面积最大。在两种进样电压、四个不同时间条件下，用0.1 M和0.02 M HCl配制的样品对峰面积影响很大。为确定LOD和LOQ，配制一系列浓度梯度的天冬氨酸和谷氨酸水溶液，5kV电压下进样15s。

天冬氨酸的LOD和LOQ分别为0.1和0.3μM，而谷氨酸的LOD和LOQ分别为0.085和0.250μM（表 4）

结论

配有LFII^®间接紫外检测器的HPCE Peregrine I被成功用于9种氨基酸残基分析，在整个浓度范围内都显示出了快速且高效的分离。

9种氨基酸残基均有极好的分辨率，迁移时间（＜0.5%RSD）和峰面积（＜2%RSD）均有很好的重现性。在高pH缓冲液条件中，使用恰当的紫外吸收添加剂可实现多种含发色团和不含发色团分析物的同时检测。尤其是注意有紫外吸收的氨基酸的负面影响。GST数据显示了信噪比的显著提高以及优秀的氨基酸残基分辨率。与此同时，EVA处理后的数据显示经顶点化处理后9个峰分辨率会显著提高。

优化后的EVA软件算法使我们可以继续使用这项强大的处理技术，使氨基酸可以清楚地被分辨和识别。

对9种氨基酸的分析证明了Peregrine I间接紫外分析技术强大的功能，使用通用缓冲液可在同一系统内同时实现多种分析物的分析，例如碳水化合物、脂质、阴离子和阳离子。

氨基酸-小分子

配有LFII^®间接紫外检测器的毛细管区带电泳氨基酸分析

使用悟空HPCE Peregrine I分析9种氨基酸的混合物，在高pH下使氨基酸残基完全离子化。间接紫外检测器使得9种氨基酸可视化。9种氨基酸残基显示了卓越的分辨率，迁移时间（＜0.5%RSD）和峰面积（＜2%RSD）均有很好的重现性。

此类检测的应用包括体外受精胚胎选择、新生儿筛查和培养基优化。

悟空HPCE的核心免标记内成像（LFII^®）技术可被用于分析物的间接紫外检测，例如碳水化合物、脂质和糖，这些物质在200~300nm范围内吸收很少。