三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量测定高效液相色谱法

参考——三七国家药品标准修订草案公示稿

2025-05-19

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一、背景

三七为五加科人参属多年生草本植物，大名鼎鼎的“金不换”；植株不算高大，一般30~60 cm，茎顶轮生着掌状复叶，模样精巧；其主根肉质，形态多样，是价值核心所在；在中国多地有种植，云南文山所产最负盛名。作为传统中药材，三七药用历史悠久，味甘微苦、性温，归肝、胃经，有散瘀止血、消肿定痛之能，是止血疗伤的良药，咯血、吐血、外伤出血等都能派上用场，还可缓解胸腹刺痛、跌扑肿痛；日常使用时，内服、外用皆可，为中医临床与养生保健常用良品。

三七的含量测定项被收录在《中国药典2020版》（一部）中，此报告中的测定方法是《三七国家药品标准修订草案公示稿》对含量测定项中色谱条件的梯度洗脱的修订。

二、实验过程

1 范围

适用于三七药材、三七粉中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量测定。

2 原理

三七粉试样经甲醇在80 ℃加热煮沸提取后，采用梯度洗脱条件，用紫外-可见光检测器检测，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2 甲醇：色谱纯；

3.3 乙腈：色谱纯；

3.4 人参皂苷Rg1标准品：CAS号为22427-39-0，纯度为99.07 %；

3.5 人参皂苷Rb1标准品：CAS号为41753-43-9，纯度为99.04 %；

3.6 三七皂苷R1标准品：CAS号为80418-24-2，纯度为98.81 %；

3.7 三种皂苷标准储备液：分别准确称取人参皂苷Rg1标准品（3.4）、人参皂苷Rb1标准品（3.5）、三七皂苷R1标准品（3.6）适量，用甲醇（3.2）溶解，分别制成每1 mL含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1 均为1 mg的标准储备液；

3.8 三种皂苷混合系列标准工作液：分别准确吸取适量的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1标准储备液（3.7），用甲醇（3.2）逐级稀释，配制成混合系列标准工作液，其中人参皂苷Rg1的浓度依次为0.04 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL和0.50 mg/mL；人参皂苷Rb1的浓度依次为0.04 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL和0.50 mg/mL；三七皂苷R1的浓度依次为0.01 mg/mL、0.025 mg/mL、0.05mg/mL、0.10 mg/mL和0.125 mg/mL。临用新制；

3.9 灵敏度溶液：分别准确吸取适量的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1标准储备液（3.7），用甲醇（3.2）稀释，分别配制成每1mL中含有人参皂苷Rg1 10 μg、人参皂苷Rb1 4 μg和三七皂苷R1 5 μg的灵敏度溶液；

3.10 三七粉试样：市售。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 分析天平：精确到0.0001 g；

4.3 超声波清洗机；

4.4 恒温水浴装置或电热套；

4.5 离心管：50 mL；

4.6 涡旋混合器；

4.7 移液器：100 μL，1000 μL；

4.8 一次性针头注射器；

4.9 微孔滤膜：0.22 µm，水相。

5 测定步骤

5.1 供试品溶液的制备

称取三七粉试样（3.10）0.6 g（精确至0.1 mg），加入甲醇（3.2）50 mL，称定重量，放置过夜，置80 ℃水浴上保持微沸2小时，放冷，再称定重量，用甲醇（3.2）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液，待高效液相色谱仪测定。

5.2 供试品加标溶液的制备

称取三七粉试样（3.10）0.6 g（精确至0.1 mg），依次加入3种皂苷标准储备液（3.7）各2.5 mL，再加入甲醇（3.2）42.5 mL，称定重量，放置过夜，置80 ℃水浴上保持微沸2小时，放冷，再称定重量，用甲醇（3.2）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品加标溶液，待高效液相色谱仪测定。

5.3 色谱条件

a）色谱柱：Endure-EC C18，4.6×250 mm，5 µm或者相当的色谱柱；

b）流动相：以乙腈（3.3）为流动相A，水（3.1）为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

注释：为使进样前系统达到稳定，每次进样前平衡10 min。

c）进样量：10 μL；

d）洗针液：90% 乙腈水溶液；

e）柱温：35 ℃；

f）检测器及检测波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为203 nm。

6 结果

6.1 重复性测试

按照色谱条件（5.3）进行采集，三种皂苷混合标准溶液（三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1浓度分别为0.10 mg/mL、0.40 mg/mL、0.40 mg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

由表1中数据可知，三七皂苷R1峰的理论塔板数为13955，满足《三七国家药品标准修订草案公示稿》中理论塔板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000的要求，对称因子为1.03；人参皂苷Rg1峰的理论塔板数为15670，对称因子为1.01；人参皂苷Rb1峰的理论塔板数为971182，对称因子为0.91，皆具有良好的峰形。

将三种皂苷混合标准溶液（三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1浓度分别为0.10 mg/mL、0.40 mg/mL、0.40 mg/mL）连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

由表2中数据可知，三种皂苷混合标准溶液连续进样7针，保留时间的RSD范围为0.03 %~0.27 %，峰面积的RSD范围为0.41 %~0.48 %，均具有良好的定性定量重复性。

6.2 仪器灵敏度测试

按照色谱条件（5.3）进行采集，灵敏度溶液（3.9）的色谱图如图3~图5所示，计算结果见表3。

由表3中数据可知，三种皂苷的仪器检出限范围为0.239 µg/mL~0.505 µg/mL，仪器定量限范围为0.798 µg/mL~1.685 µg/mL。

6.3 含量测定

6.3.1 校准曲线绘制

按照色谱条件（5.3），将三种皂苷混合系列标准工作液（3.8）上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数如图6~图8所示。

由图6~图8可知，三七皂苷R1在0.01 mg/mL~0.125 mg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系；人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在0.04 mg/mL~0.50 mg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R2均＞0.999。

三种皂苷混合系列标准工作液叠加的色谱图如图9所示。

图9 三种皂苷混合系列标准工作液叠加的色谱图

6.3.2 含量测定

按照色谱条件（5.3），对空白溶液、供试品溶液和供试品加标溶液（5.1和5.2）进行采集，依据公式（1）计算三七粉试样中三种皂苷的含量。

式中：ω----为试样中三七皂苷R1/人参皂苷Rg1/人参皂苷Rb1的含量，单位为百分数（%）；

C----为通过校准曲线得到的测试液中三七皂苷R1/人参皂苷Rg1/人参皂苷Rb1的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；

V----为试样的定容体积，单位为毫升（mL）；

m----为试样的质量，单位为克（g）；

103、100----为单位换算系数。

空白溶液、供试品溶液和供试品加标溶液的色谱图如图10~图12所示。

依据公式（1）进行计算，三七粉试样中三七皂苷R1的含量为0.7 %，人参皂苷Rg1的含量为4.2 %，人参皂苷Rb1的含量为2.5 %，三种皂苷的含量为7.4 %，满足《三七国家药品标准修订草案公示稿》中三七含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1的总量不得少于6%的要求；加标回收实验中，三七皂苷R1的加标回收率为84.0 %，人参皂苷Rg1的加标回收率为82.8 %，人参皂苷Rb1的加标回收率为98.5 %。

三、结论

本实验以乙腈和水为流动相，采用反相色谱法，使用梯度洗脱条件，通过对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的理论塔板数、峰形、重复性以及对三七粉中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量进行测定，实验结果表明：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的理论塔板数范围为13955~971182，满足《三七国家药品标准修订草案公示稿》中理论塔板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000的要求；拖尾因子范围为0.91~1.03，均具有良好的峰形；三种皂苷混合标准溶液连续进样7针重复性测试中，保留时间的RSD范围为0.03 %~0.27 %，峰面积的RSD范围为0.41 %~0.48 %，均具有良好的定性定量重复性；三种皂苷的仪器检出限范围为0.239 µg/mL~0.505 µg/mL，仪器定量限范围为0.798 µg/mL~1.685 µg/mL；三种皂苷在测定浓度范围内皆呈现良好的线性关系，确定系数R2均＞0.999；三七粉试样中三七皂苷R1的含量为0.7 %，人参皂苷Rg1的含量为4.2 %，人参皂苷Rb1的含量为2.5 %，三种皂苷的含量为7.4 %，满足《三七国家药品标准修订草案公示稿》中三七含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1的总量不得少于6%的要求；加标回收实验中，三七皂苷R1的加标回收率为84.0 %，人参皂苷Rg1的加标回收率为82.8 %，人参皂苷Rb1的加标回收率为98.5 %。因此，悟空 K2025高效液相色谱仪可以满足《三七国家药品标准修订草案公示稿》对三七粉中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1含量测定的需求。