一、 摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定牛奶中三聚氰胺的含量。色谱条件：C₁₈ 4.6×250mm，5μm，流速为1.0mL/min，柱温为40℃，进样量为20μL，检测波长为240nm。实验结果：三聚氰胺在测定浓度范围内具有良好的线性关系（R²=0.9998）；三聚氰胺的仪器检出限为0.064μg/mL，仪器定量限为0.212μg/mL。按照标准规定称样量，满足《GB/T 22388-2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中高效液相色谱法的检出限2mg/kg的要求。

二、 背景

三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是一种化工原料，为白色晶体，无明显异味，禁止添加到食品中。一般牛奶中蛋白质的检测方法是通过检测牛奶里面的氮含量来推算蛋白质，由于三聚氰胺的氮含量高达66%，价格便宜，常被不法分子非法添加到牛奶或乳制品中。但是，长期摄入过量的三聚氰胺会引发膀胱炎症、上皮增生、结石等，甚至导致膀胱癌。

2011年4月6日，《关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告》：三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加剂，禁止人为添加到食品中。对在食品中人为添加三聚氰胺的，依法追究法律责任。婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于上述限量的食品一律不得销售。

三、 实验过程

1 范围

适用于牛奶中三聚氰胺的含量测定。

2 原理

试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T6682的一级水；

3.2 甲醇：色谱纯；

3.3 乙腈：色谱纯；

3.4 乙酸锌：分析纯；

3.5 冰乙酸：分析纯；

3.6 三氯乙酸：分析纯；

3.7 柠檬酸：分析纯；

3.8 辛烷磺酸钠：色谱纯；

3.9 氨水：分析纯，含量为25%~28%；

3.10 甲醇水溶液：准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀后备用；

3.11 三氯乙酸溶液（质量分数为2%）：准确称取20g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀备用；

3.12 乙酸锌溶液（质量浓度为20g/L）：准确称取2g乙酸锌于100mL容量瓶中，加入5mL冰乙酸，用水溶解并定容至100mL；

3.13 5%氨化甲醇：量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用；

3.14 流动相A：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980mL水溶解，调节pH至3.0后，定容至1L备用；

3.15 三聚氰胺标准品：CAS号：108-78-01，纯度大于99.0%；

3.16 三聚氰胺标准储备液：准确称取10mg（精确到0.1mg）三聚氰胺标准品于10mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.10）溶解并定容至刻度，配制成三聚氰胺浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存；

3.17 三聚氰胺标准中间液：准确量取1mL三聚氰胺标准储备液（3.16），用流动相定容至10mL，制得浓度为100µg/mL的三聚氰胺标准中间液；

3.18 三聚氰胺标准工作液：将三聚氰胺标准中间液（3.17）用流动相稀释并定容配制成标准工作液，三聚氰胺系列浓度依次为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和80µg/mL；

3.19 混合型阳离子交换固相萃取柱：基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物；

3.20 微孔滤膜：0.22µm，有机相；

3.21 氮气：纯度≥99.999%。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 分析天平：精确到0.0001g；

4.3 涡旋振荡器；

4.4 pH计；

4.5 离心机：转速不低于4000r/min；

4.6 固相萃取装置；

4.7 氮气吹干仪；

4.8 超声波清洗机；

4.9 离心管：10mL 、50mL，带盖；

4.10 容量瓶：10mL、1000mL，棕色带刻度。

5 测定步骤

5.1 样品前处理

样品提取：称取2g（精确至0.01g）牛奶于50mL离心管中，依次加入3mL乙酸锌溶液（3.12）、15mL三氯乙酸溶液（3.11）和5mL乙腈（3.3），超声提取10min，再振荡提取10min后，定容至25mL，于4000r/min条件下离心10min，取上清液过滤；准确移取5mL续滤液于10mL离心管中，加入5mL水混匀，即为待净化液。

活化：依次使用3mL甲醇、5mL水对固相萃取柱（3.19）进行活化，流速为1滴/s。

净化：将待净化液转移至固相萃取柱（3.19）中，依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液（3.13）洗脱，流速为1滴/s；将洗脱液收集后，于50℃下用氮气吹干；残留物用1mL流动相定容，涡旋混匀1min，用0.22µm微孔滤膜过滤后，供HPLC测定。

5.2 色谱条件

a）色谱柱：C₁₈ 4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：流动相A（3.14）：乙腈=85:15；

c）柱温：40℃；

d）进样量：10μL；

e）流速：1.0mL/min；

f）波长：240nm。

6 结果

6.1 重复性测试

按照上述色谱条件（5.2）进行采集，三聚氰胺标准溶液（浓度为5µg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

图1三聚氰胺标准溶液的色谱图

表1 三聚氰胺标准溶液色谱图积分结果

由表1可知，三聚氰胺的理论塔板数为23488，拖尾因子为0.95，具有较好的峰型。

将三聚氰胺标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

 

图2三聚氰胺标准溶液连续进样7针叠加的色谱图

表2三聚氰胺标准溶液连续进样7针重复性数据统计

由表2可知，三聚氰胺标准溶液连续进样7针，三聚氰胺保留时间的RSD为0.101%，峰面积的RSD为0.125%。

6.2 仪器灵敏度测试

灵敏度测试的谱图如图3所示，计算结果见表3。

 

图3仪器灵敏度的色谱图

表3仪器灵敏度测试数据

由表3数据可知，三聚氰胺的仪器检出限为0.064µg/mL，仪器定量限为0.212µg/mL。

6.3 含量测定

6.3.1 校准曲线

将配制好的三聚氰胺标准工作液（3.18）在HPLC上进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程及相关系数见图4，叠加色谱图见图5。三聚氰胺在测定浓度范围内，曲线的相关系数R²达到0.9998，线性关系良好。

 

图4三聚氰胺标准溶液的校准曲线

 

图5三聚氰胺标准溶液浓度系列曲线叠加色谱图

6.3.2 样品含量测定

购买纯牛奶作为样品，按照5.1的流程对样品进行处理，并根据样品的含量，对样品进行加标回收实验。按照公式（1）进行计算，样品的色谱图及样品加标的色谱图如图6及图7所示。

式中：ω----为样品中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

C----为通过校准曲线计算的样品中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V----为样品的定容体积，单位为毫升（mL）；

m----为样品质量，单位为克（g）；

f-----为稀释倍数；

1000----为换算系数。

 

图6纯牛奶样品的色谱图

 

图7纯牛奶样品加标的色谱图

经计算，此纯牛奶样品中三聚氰胺的含量为0.4mg/kg，由于《GB/T 22388-2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中高效液相色谱法的检出限为2mg/kg，因此，样品中三聚氰胺的含量为未检出，样品加标回收率为96.3%。

7 结论

通过对三聚氰胺的峰型、重复性、灵敏度、线性的测试以及对纯牛奶样品中三聚氰胺的含量进行测定，实验结果表明：用K2025测定三聚氰胺，三聚氰胺峰的理论塔板数为23488，对称因子为0.95，峰型良好；在测定浓度范围内，三聚氰胺具有良好的线性关系，确定系数R²为0.9998；重复性测试中，连续进样7针，三聚氰胺保留时间的RSD为0.101%，峰面积的RSD范围为0.125%，定性定量均有良好的重复性；三聚氰胺的仪器检出限为0.064µg/mL，仪器定量限为0.212µg/mL；样品中三聚氰胺的含量为未检出，加标回收率为96.3%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《GB/T 22388-2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中使用高效液相色谱法测定三聚氰胺含量的需求。