一、摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定苍耳子中绿原酸的含量。色谱条件：C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为5μL，检测波长为327nm。实验结果：绿原酸峰的理论塔板数为9948；在连续进样7针的重复性测试中，绿原酸保留时间的RSD为0.162%，峰面积的RSD为0.391%；绿原酸的仪器检出限为0.104μg/mL，仪器定量限为0.345μg/mL；对苍耳子样品进行测定，苍耳子中绿原酸的含量为0.54%，加标回收率为87.9%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《中国药典（2020年版）一部》中苍耳子中绿原酸含量测定的需求。

二、背景

苍耳子属菊科、苍耳属一年生草本菊科植物苍耳的带总苞的果实，属于常用中草药，具有散风、除湿、通窍等功效。

绿原酸是一种有机化合物，半水合物为针状结晶（水），110℃变为无水化合物，25℃水中溶解度为4%，热水中溶解度更大，易溶于乙醇及丙酮，极微溶于醋酸乙酯。绿原酸具有抗艾滋病毒、抗肿瘤细胞、抗菌、提高中枢兴奋、利胆、抗致畸、抗过敏及调节细胞色素P450连接酶的活性等功能。

三、实验过程

1范围

适用于苍耳子中绿原酸的含量测定。

2原理

苍耳子中的绿原酸经含5%甲酸的50%甲醇溶液超声提取，在327nm处有紫外吸收，使用高效液相色谱法测定，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2甲醇：色谱纯；

3.3 甲酸：色谱纯；

3.4 5%甲酸的50%甲醇溶液：取500mL甲醇（3.2），加入50mL甲酸（3.3），用水定容至1L；

3.5 绿原酸对照品：CAS号：520-18-3，纯度：99.2%；

3.6 乙腈：色谱纯；

3.7 磷酸：色谱纯；

3.8 0.4%磷酸溶液：精密量取磷酸（3.7）4mL，用水定容至1L；

3.9 流动相：乙腈:0.4%磷酸溶液（3.8）=50:50；

3.10 市售苍耳子饮片样品。                                                                   

4 仪器与设备

4.1高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2分析天平：精确到0.0001g；

4.3 超声波清洗机；

4.4涡旋振荡器；

4.5容量瓶：10mL，棕色带刻度；

4.6具塞锥形瓶：100mL；

4.7 0.22μm微孔滤膜，有机相。

5 测定步骤

5.1 标准溶液的配制

5.1.1 绿原酸标准储备液：取绿原酸对照品（3.5）适量，用5%甲酸的50%甲醇溶液（3.4）溶解，配制成绿原酸浓度为1.0mg/mL的标准储备液。

5.1.2 绿原酸标准系列工作液：分别取绿原酸标准储备液（5.1.1）适量，用5%甲酸的50%甲醇溶液（3.4）配制成浓度分别为5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL、200.0μg/mL的标准系列工作液。

5.2 供试品溶液的制备

取经粉碎的苍耳子样品粉末约0. 5g，精密称定，置于具塞锥形瓶（4.6）中，精密加入5%甲酸的50%甲醇溶液（3.4）25mL，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用5%甲酸的50%甲醇溶液（3.4）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液（置棕色瓶中），即得。

5.3色谱条件

a）色谱柱：C18，4.6×250mm，5µm或者相当的色谱柱；

b）流动相：详见3.9；

c）流速：1.0mL/min；

d）进样量：5μL；

e）柱温：30℃；

f）检测器及波长：紫外-可见光检测器，检测波长为327nm。

6实验结果

6.1 重复性测试

按照上述色谱条件（5.3）进行采集，绿原酸标准溶液（浓度为50μg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

图1 绿原酸标准溶液的色谱图

表1 绿原酸标准溶液色谱图积分结果

由表1中数据可知，绿原酸峰的理论塔板数为9948，满足《中国药典（2020年版）一部》中理论塔板数按绿原酸峰计算应不小于3000的要求。 

将绿原酸标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

 

图2 绿原酸标准溶液叠加的色谱图

表2 绿原酸标准溶液连续进样7针重复性数据统计

将绿原酸标准溶液连续进样7针进行重复性测试，绿原酸保留时间的RSD为0.162%，峰面积的RSD为0.391%，具有良好的定性定量重复性。

6.2仪器灵敏度测试

灵敏度测试的色谱图如图3所示，计算结果见表3。

 

图3 仪器灵敏度的色谱图

表3 仪器灵敏度测试数据

通过计算，绿原酸的仪器检出限为0.104μg/mL，仪器定量限为0.345μg/mL。 

6.3含量测定

6.3.1 校准曲线

按照上述色谱条件（5.3）进行采集，将绿原酸标准系列工作液（5.1.2）上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数如图4所示。

 

图4绿原酸的校准曲线

由图4可知，绿原酸在测定浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R2在0.999以上。绿原酸标准系列工作液叠加的色谱图如图5所示。

 

图5绿原酸标准工作液叠加色谱图

6.3.2含量测定

按照步骤5.2对市售苍耳子样品进行处理。依据公式（1）进行计算，苍耳子样品及苍耳子样品加标的色谱图如图6~图7所示。

式中：ω----为苍耳子试样中绿原酸的含量，单位为百分数（%）；

C----为通过校准曲线得到的试样中绿原酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V----为试样的定容体积，单位为毫升（mL）；

m----为试样的质量，单位为克（g）；

106和100----为换算系数。

 

图6 苍耳子样品的色谱图     

图7 苍耳子样品加标的色谱图

由公式（1）计算苍耳子样品中绿原酸的含量，该样品中绿原酸的含量为0.54%，满足《中国药典（2020年版）一部》中绿原酸含量不得少于0.25%的要求，加标回收率为87.9%。

四、结论

通过对绿原酸的理论塔板数、重复性、灵敏度的测定以及对苍耳子中绿原酸含量进行测定，实验结果表明：绿原酸峰的理论塔板数为9948，满足《中国药典（2020年版）一部》中理论塔板数按绿原酸峰计算应不小于3000的要求；在重复性测试中，绿原酸保留时间的RSD为0.162%，峰面积的RSD为0.391%，具有良好的定性定量重复性；绿原酸的仪器检出限为0.104μg/mL，仪器定量限为0.345μg/mL；对苍耳子样品进行测定，该样品中绿原酸的含量为0.54%，满足《中国药典（2020年版）一部》中绿原酸含量不得少于0.25%的要求，加标回收率为87.9%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《中国药典（2020年版）一部》中苍耳子中绿原酸含量测定的需求。

附1：仪器配置清单

附2：悟空Wooking  K2025高效液相色谱仪（可靠、精准、友好、合规）

 

报告人：张帆      

联系方式：15120069384