一、 摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定酒黄精中黄精多糖水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量。色谱条件：C₁₈色谱柱， 4.6×250mm，5μm，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL，检测波长为254nm。实验结果：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的理论塔板数范围为15619~17719；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的拖尾因子范围为1.02~1.20；重复性测试中，混合标准溶液连续进样7针，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖保留时间的RSD范围为0.072~0.210%，峰面积的RSD范围为0.578~0.780%；在测定浓度范围内，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖均具有良好的线性关系，确定系数R²均大于0.999；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖仪器检出限范围为0.013µg/mL~0.041µg/mL，仪器定量限范围为0.043µg/mL~0.137µg/mL；酒黄精样品中多糖水解产物甘露糖的含量为6.067mg/g，葡萄糖的含量为72.250mg/g，半乳糖的含量为3.436mg/g，木糖的含量为0.839mg/g。因此，K2025满足酒黄精样品中黄精提取液水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量测定需求。

二、 背景

黄精是一种滋补类中药，有抗炎、抗菌作用，能够治疗伤寒以及感染性腹泻，也能够抗氧化，减少心肌缺血，保护心血管，保护心脏功能。黄精还可以降低血糖，减少疲劳感，延缓衰老，增加机体免疫力，强筋健骨，对于亚健康状态，具有很好补益作用。其中，黄精多糖的生物活性主要在免疫调节、抗氧化、降血糖、抗炎、抗肿瘤等方面。

三、 实验过程

1 范围

适用于酒黄精中黄精多糖水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量测定。

2 原理

样品经三氟乙酸提取后由黄精多糖水解为单糖，水解液中的单糖与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行衍生反应，C₁₈色谱柱分离，衍生物在254nm有紫外吸收，用配有紫外检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2 磷酸二氢钾：分析纯；

3.3 氢氧化钾：分析纯；

3.4 乙腈：色谱纯；

3.5 流动相：A相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（称取6.8g磷酸二氢钾（3.2），加入1000mL水，用KOH溶液调pH至6.80）；B相：乙腈；

3.6 三氟乙酸：分析纯；

3.7 2mol/L三氟乙酸溶液：称取11.4g三氟乙酸（3.6），加50mL水，混匀；

3.8 氢氧化钠：分析纯；

3.9 2mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠（3.8）4g，加50mL水，混匀；

3.10 0.3mol/L氢氧化钠溶液：取2mol/L氢氧化钠溶液（3.9）6mL，加入34mL水，混匀；

3.11 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）：分析纯；

3.12 0.5mol/L PMP甲醇溶液：称取4.3gPMP(3.11)，加50mL甲醇；

3.13 盐酸：分析纯；

3.14 0.3mol/L盐酸溶液：取盐酸（3.13）1.25mL，加48.75mL水，混匀；

3.15 三氯甲烷：分析纯；

3.16 甘露糖对照品：CAS号：3458-28-4，纯度为99.8%；

3.17 甘露糖标准储备液：取一定量的甘露糖对照品（3.16），用水配制成浓度为1mg/mL       的标准储备液；

3.18 葡萄糖对照品：CAS号：50-99-7，纯度为98.6%；

3.19 葡萄糖标准储备液：取一定量的葡萄糖对照品（3.18），用水配制成浓度为1mg/mL       的标准储备液；

3.20 半乳糖对照品：CAS号：59-23-4，纯度为99.9%；

3.21 半乳糖标准储备液：取一定量的半乳糖对照品（3.20），用水配制成浓度为1mg/mL       的标准储备液；

3.22 木糖对照品：CAS号：58-86-6，纯度为99.9%；

3.23 木糖标准储备液：取一定量的木糖对照品（3.22），用水配制成浓度为1mg/mL       的标准储备液；

3.24 混合标准溶液：分别移取一定量的甘露糖标准储备液（3.17）、葡萄糖标准储备液（3.19）、半乳糖标准储备液（3.21）、木糖标准储备液（3.23），用水稀释，配制成浓度均为250μg/mL的混合标准溶液；

3.25 微孔滤膜：0.22µm，有机相。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 分析天平：精确到0.0001g；

4.3 涡旋振荡器；

4.4 超声波清洗机；

4.5 pH计：精确到0.01；

4.6 高速离心机；

4.7 容量瓶：10mL，棕色带刻度。

5 测定步骤

5.1 样品前处理

将酒黄精样品研细，准确称取约1.0g，置于10mL容量瓶中，加2mol/L三氟乙酸溶液（3.7）约4mL，80℃超声提取2h，放冷，用2mol/L氢氧化钠溶液（3.9）调pH至中性，加水定容至刻度线，摇匀，以4000r/min的转速离心5min，取上清液，过0.22µm滤膜。

5.2 衍生化处理

分别取经5.1处理后的酒黄精样品及混合标准溶液（3.24）200μL于2mL避光离心管中，加入0.5mol/LPMP甲醇溶液（3.12）200μL，再加入0.3mol/L氢氧化钠溶液（3.10）200μL，混匀。避光条件下70℃水浴1h，放置室温10min，加入0.3mol/L盐酸溶液（3.14）200μL，混匀。加入1mL三氯甲烷（3.15），充分萃取后，除去三氯甲烷层（下层），用三氯甲烷反复萃取3次，取上层清液，加水200μL，过0.22µm滤膜。

5.3 混合标准系列工作液配制

取适量经（5.2）衍生后的混合标准溶液（3.24），分别用水稀释成浓度依次为2.500μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL的标准系列工作液。

5.4 色谱条件

a）色谱柱：C₁₈色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：详见3.5;

梯度洗脱程序如下：

c）流速：1.0mL/min；

d）进样量：10μL；

e）柱温：25℃；

f）检测器及波长：紫外-可见光检测器，检测波长为254nm。

6 结果

6.1 重复性测试

按照上述色谱条件（5.4）进行采集，混合标准工作液（浓度为10µg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

图1混合标准工作液的色谱图

表1 混合标准工作液色谱图积分结果

由表1中数据可知，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的理论塔板数范围为15619~17719；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的拖尾因子范围为 1.02~1.20。

将混合标准工作液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

图2混合标准工作液连续进样7针叠加的色谱图

表2混合标准工作液连续进样7针重复性数据统计

由表2中数据可知，混合标准溶液连续进样7针，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖保留时间的RSD范围为0.072~0.210%，峰面积的RSD范围为0.578~0.780%，均具有良好的定性定量重复性。

6.2 仪器灵敏度测试

灵敏度测试的谱图如图3所示，计算结果见表3。

图3仪器灵敏度的色谱图

表3仪器灵敏度测试数据

由表3中数据可知，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖仪器检出限范围为0.013µg/mL~

0.041µg/mL，仪器定量限范围为0.043µg/mL~0.137µg/mL。

6.3 含量测定

6.3.1 校准曲线

将配制好的标准系列工作液（5.3）在HPLC上进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程及确定系数见图4~图7，叠加色谱图见图8。

图4甘露糖标准工作液的校准曲线

图5葡萄糖标准工作液的校准曲线

图6半乳糖标准工作液的校准曲线

图7木糖标准工作液的校准曲线

图8混合标准工作液浓度系列叠加色谱图

由图4~图7可知，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R²均在0.999以上。

6.3.2 样品含量测定

以酒黄精为样品，按照5.1~5.2的流程对样品进行处理，并计算样品中多糖水解产物的含量。按照公式（1）进行计算，样品的色谱图如图9所示。

式中：ω----为样品中多糖水解后甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量，单位为毫克每克（mg/g）；

C----为通过校准曲线计算的样品中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V----为样品的定容体积，单位为毫升（mL）；

m----为样品质量，单位为克（g）；

f-----为稀释倍数；

1000----为换算系数。

图9酒黄精样品的色谱图

经计算，此酒黄精样品中甘露糖的含量为6.067mg/g，葡萄糖的含量为72.250mg/g，半乳糖的含量为3.436mg/g，木糖的含量为0.839mg/g。

7 结论

通过对甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的理论塔板数、重复性、灵敏度、线性的测试以及对酒黄精样品中黄精提取液水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量进行测定，实验结果表明：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的理论塔板数范围为15619~17719；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的拖尾因子范围为 1.02~1.20；重复性测试中，混合标准溶液连续进样7针，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖保留时间的RSD范围为0.072~0.210%，峰面积的RSD范围为0.578~0.780%，均具有良好的定性定量重复性；在测定浓度范围内，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖均具有良好的线性关系，确定系数R²均大于0.999；甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖仪器检出限范围为0.013µg/mL~0.041µg/mL，仪器定量限范围为0.043µg/mL~0.137µg/mL；酒黄精样品提取液水解产物甘露糖的含量为6.067mg/g，葡萄糖的含量为72.250mg/g，半乳糖的含量为3.436mg/g，木糖的含量为0.839mg/g。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足酒黄精样品中黄精提取液水解产物甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的含量测定需求。

附1：仪器配置清单

附2：悟空Wooking  K2025高效液相色谱仪（可靠、精准、友好、合规）