生物胺是一类由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成的弱碱性低分子量含氮化合物，在机体生命活动中发挥着重要作用，但在体内聚集到高水平时或在摄入量很高时会表现出毒性，其中毒症状包括呼头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及生命。

根据其组成成分生物胺可分为两类：单胺和多胺；单胺主要有酪胺、组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺等，多胺主要包括精胺和亚精胺。动物体内残留的生物胺含量与摄入的动物源性饲料原料如鱼粉、肉骨粉、家禽副产品中生物胺的含量直接相关。因此，国家对于动物源性饲料中的生物胺含量设定了严格的限量标准。

本实验参照《GB/T 23884-2021 动物源性饲料中生物胺的测定 高效液相色谱法》使用悟空Wooking K2025高效液相色谱仪对饲料中的生物胺含量进行测定。

实验部分

饲料中生物胺的含量测定高效液相色谱法

实验部分：

饲料中生物胺的含量测定 高效液相色谱法

【仪器与试剂】

仪器与设备：悟空K2025高效液相色谱仪；分析天平（精确到0.0001g）；涡旋振荡器；

超声波清洗机；离心机；恒温摇床；氮气吹干仪；容量瓶（100mL、1000mL，棕色带刻度）。

试剂与材料：符合GB/T6682的一级水；乙腈、氨水、乙酸铵[色谱纯]；丙酮、氢氧化钠、碳酸氢铵、盐酸[分析纯]；高氯酸(纯度为70%~72%)；丹磺酰氯(纯度≥99%)；色胺(纯度为99.3%)；苯乙胺(纯度为99.9%)；腐胺·二盐酸(纯度为99.7%)；尸胺(纯度为98.1%)；组胺(纯度为98.3%)；章鱼胺·一盐酸(纯度为97%)；酪胺(纯度为99.5%)；亚精胺·三盐酸(纯度为99.5%)；精胺(纯度为97.2%)；微孔滤膜(0.22µm，有机相)。

【样品前处理】

样品提取：称取1g（精确至0.0001g）鱼粉样品于50mL离心管中，准确加入10mL 的0.4mol/L高氯酸提取液，涡旋混匀，置于恒温摇床上，室温下200r/min振荡10min，然后于5000r/min条件下离心10min，将上清液转移至另一50mL离心管中，残渣再用10mL的0.4mol/L高氯酸提取液提取，重复上述操作，合并上清液，备用。

衍生：准确移取上清液1mL，置于15mL具塞离心管中，依次加入200µL的2mol/L氢氧化钠溶液、300µL的2mol/L饱和碳酸氢钠溶液和2mL的10mg/mL丹磺酰氯衍生溶液，涡旋混匀，置于恒温摇床上，于45℃避光反应45min；然后加入100µL氨水终止反应，混匀，静置15min，45℃氮吹去丙酮，用乙腈定容至5mL，超声复溶，混匀，用0.22µm有机微孔滤膜过滤备用。

精密量取混合标准系列溶液各1mL与试样溶液同时进行衍生。

【色谱条件】

a）色谱柱: C18  4.6×250mm，5μm

b）流动相A为乙腈，流动相B为5mMol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱设置如下表：

c）柱温：30℃

d）进样量：10μL

e）流速：1.0 mL/min

f）波长：254nm

【结果与讨论】：

1. 9种生物胺混合标准溶液色谱图如图1所示，结合色谱积分数据（表1）可知，9种生物胺的分离度均大于1.5，对称因子在0.97-1.16之间，具有良好的分离度和色谱峰形。

图1  9种生物胺混合标准溶液色谱图

表1  9种生物胺混合标准溶液色谱积分结果

2. 将生物胺混合标准溶液逐级稀释至信噪比S/N为3左右，计算仪器的检出限，数据结果见表2，9种生物胺的检出限为0.002－0.010µg/mL，定量限为0.010－0.033µg/mL。

表2 灵敏度测试数据

3. 将生物胺混合标准溶液在HPLC上进行测定，绘制校准曲线，线性方程见图2，9种生物胺在测定浓度范围内，曲线的确定系数R2均达到0.9990，线性关系良好。

4. 购买市售鱼粉饲料作为样品进行处理，并计算样品中各生物胺的含量。经计算，此鱼粉饲料样品中9种生物胺的含量详见表3。

表3鱼粉饲料样品中9种生物胺的含量

【结论】

使用K2025高效液相色谱仪测定鱼粉饲料中的生物胺，实验结果表明：9种生物胺色谱峰的理论塔板数均大于30000，对称因子在0.97-1.16之间，峰型良好；在测定浓度范围内，9种生物胺具有良好的线性关系，确定系数R2均大于0.9990；重复性测试中，连续进样7针的保留时间的RSD在0.024%~0.048%，峰面积的RSD在 0.162%~0.396%，定性定量均有良好的重复性；9种生物胺的检出限均不大于0.010µg/mL，定量限均不大于0.033µg/mL。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪完全满足《GB/T 23884-2021 动物源性饲料中生物胺的测定 高效液相色谱法》标准中对饲料中9种生物胺含量测定的需求。