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悟空仪器
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前言
近日，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、中国医学科学院药用植物研究所等单位共同制定的国家标准《饲料添加剂淫羊藿提取物中黄酮醇苷的测定 高效液相色谱法》（GB/T 43810-2024）通过了国家市场监管总局（国家标准化管理委员会）批准，并于2024年10月1日起正式实施。
1、实验方案
淫羊藿提取物作为饲料添加剂领域中的关键“替代抗生素”成分，其多样性、检测手段的不一致性以及生产过程的差异性，造成了市场上淫羊藿提取物有效成分的组成和含量存在较大波动。为了规范市场监管，确保养殖业能够安全有效地使用这些添加剂，针对淫羊藿提取物检测方法的不统一性和质量控制成分的代表性不足等问题，主导制定了新的国家标准。该标准详细阐述了如何使用高效液相色谱法来测定淫羊藿提取物中的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷以及宝藿苷I这5种主要的黄酮醇苷成分。
悟空实验室遵循新制定的国家标准，对淫羊藿提取物中黄酮醇苷的高效液相色谱测定方法进行了重现。
以下是实验室重现该检验方法的详细条件和结果：
色谱条件
色谱柱：C18，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；
流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱程序见下表：
进样量：20 μL；
洗针液：90%甲醇水溶液；
柱温：30℃;
检测器及检测波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为270 nm。
实验结果
重复性测试
待仪器工作状态稳定后，按照色谱条件进行采集，5种黄酮醇苷混合标准溶液（浓度均为20 µg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。
图1 5种黄酮醇苷混合标准溶液（浓度均为20 µg/mL）的色谱图
表1 5种黄酮醇苷混合标准溶液（浓度均为20 µg/mL）色谱图积分结果
由表1中数据可知，5种黄酮醇苷的分离度≥3.83，均可以达到基线分离；拖尾因子≤1.22，均具有良好的峰形。
将5种黄酮醇苷混合标准溶液（浓度均为20 µg/mL）连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。
图2 5种黄酮醇苷混合标准溶液（浓度均为20 µg/mL）连续进样7针叠加的色谱图
表2 5种黄酮醇苷混合标准溶液（浓度均为20 µg/mL）连续进样7针重复性数据统计
由表2中数据可知，5种黄酮醇苷混合标准溶液（浓度均为20 µg/mL）连续进样7针进行重复性测试，其中朝藿定A保留时间的RSD为0.077%，峰面积的RSD为0.100%；朝藿定B保留时间的RSD为0.079%，峰面积的RSD为0.124%；朝藿定C保留时间的RSD为0.051%，峰面积的RSD为0.114%；淫羊藿苷保留时间的RSD为0.026%，峰面积的RSD为0.109%；宝藿苷I保留时间的RSD为0.025%，峰面积的RSD为0.271%，均具有良好的定性定量重复性。
含量测定
校准曲线
将配制好的5种黄酮醇苷混合标准工作液在HPLC上进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程及确定系数见图3。5种黄酮醇苷在0.05 µg/mL~200 µg/mL浓度范围内，曲线的确定系数R2均≥0.999，线性关系均良好。
图3 5种黄酮醇苷的校准曲线
含量测定
以市售的淫羊藿提取物作为试样，按照流程对试样进行处理，并根据5种黄酮醇苷的含量，进行加标回收实验。
空白溶液、试样溶液及试样加标溶液的色谱图如图4~图6所示，试样中5种黄酮醇苷的含量及加标回收率见表3。
图4 空白溶液的色谱图
图5 试样溶液的色谱图
图6 试样加标溶液的色谱图
表3 试样中黄酮醇苷含量及加标回收率结果表
依据公式进行计算，饲料添加剂淫羊藿提取物试样中5种黄酮醇苷的含量范围为0.000g/kg~0.241g/kg，加标回收率范围在94.26%~100.50%之间。
结论
1、5种黄酮醇苷的分离度≥3.83，均可以达到基线分离；拖尾因子≤1.22，均具有良好的峰形；
2、重复性测试中，5种黄酮醇苷混合标准溶液连续进样7针，其保留时间的RSD范围为0.025%~0.079%，峰面积的RSD范围为0.100%~0.271%，均具有良好的定性定量重复性；
3、5种黄酮醇苷在0.05 µg/mL~200 µg/mL浓度范围内均具有良好的线性关系（R2＞0.999）；
4、在饲料添加剂淫羊藿提取物试样中5种黄酮醇苷的含量范围为0.000 g/kg~0.241 g/kg，加标回收率范围在94.26%~100.50%之间。
因此，悟空K2025高效液相色谱仪满足《饲料添加剂淫羊藿提取物中黄酮醇苷的测定 高效液相色谱法》（GB/T 43810-2024）中对这5种黄酮醇苷含量测定的需求。
这项标准的发布实施，对完善植物提取物类饲料添加剂的质量标准体系，促进我国畜牧、医药等相关行业高质量发展具有重要意义。
