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一、摘要
本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定化妆品中溴米索伐和卡溴脲的含量。色谱条件：C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为210nm。实验结果：溴米索伐和卡溴脲的分离度为13.51，其理论塔板数分别为14956和17920，拖尾因子分别为1.12和1.09；重复性测试中，将混合标准溶液连续进样7针，溴米索伐保留时间的RSD为0.142%，峰面积的RSD为0.429%，卡溴脲保留时间的RSD为0.113%，峰面积的RSD为0.410%；灵敏度测试中，溴米索伐的仪器检出限为0.014μg/mL，仪器定量限为0.046μg/mL，卡溴脲的仪器检出限为0.035μg/mL，仪器定量限为0.115μg/mL；溴米索伐和卡溴脲在测定浓度范围内均具有良好的线性关系，确定系数R2均＞0.999；对啫喱面霜试样进行测定，溴米索伐和卡溴脲均未检出，加标回收率分别为104.4和101.6%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪满足《GB/T 40899-2021 化妆品中禁用物质溴米索伐、卡溴脲和卡立普多的测定 高效液相色谱法》中溴米索伐和卡溴脲含量测定的需求。
二、背景
溴米索伐，化学名为2-溴-N-氨基甲酰基-3-甲基丁酰胺，白色结晶性粉末，无臭，味微苦，在丙酮中易溶，在乙醇或乙醚中溶解，在水中微溶。溴米索伐通常称为溴戊酰脲，为镇静催眠药，可用于禁忌巴比妥类或水合氯醛的患者。
卡溴脲，又称二乙溴乙酰脲，在体内水解释放出溴离子，慢性中毒时可导致溴中毒及血小板减少性紫癜和精神紊乱。
溴米索伐和卡溴脲是我国《化妆品安全技术规范（2015年版）》规定的禁用原料。
三、实验过程
1 范围
适用于水剂类、乳液类和膏霜类化妆品中溴米索伐和卡溴脲的含量测定。
2原理
试样经溶剂超声提取后，提取液经离心、氮吹、重新定容并过滤，以配备二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行测定，根据保留时间初步定性，外标法定量。
3 试剂与材料
3.1水：符合GB/T 6682的一级水；
3.2甲醇：色谱纯；
3.3乙腈：色谱纯；
3.4氯化钠：优级纯；
3.5 40%乙腈溶液：量取40mL乙腈（3.3）加入100mL容量瓶中，加水稀释并定容至刻度；
3.6溴米索伐对照品：CAS号为496-67-3，纯度为98.0%；
3.7卡溴脲对照品：CAS号为77-65-6，纯度为99.6%；
3.8 标准储备液：准确称取溴米索伐对照品（3.6）和卡溴脲对照品（3.7）各约10mg，分别置于10mL棕色容量瓶中，用40%乙腈溶液（3.5）溶解并定容至刻度，摇匀，制得溴米索伐标准储备液的浓度为1146.600μg/mL，卡溴脲标准储备液的浓度为747.000μg/mL，于4℃避光保存，有效期2个月；
3.9混合标准溶液：准确吸取上述标准储备液（3.8）各0.5mL，分别置于10mL棕色容量瓶中，用40%乙腈溶液（3.5）稀释并定容至刻度，摇匀，制得混合标准溶液，其中溴米索伐的浓度为57.330μg/mL，卡溴脲的浓度为37.350μg/mL；
3.10混合系列标准工作液：分别准确吸取溴米索伐标准储备液和卡溴脲标准储备液（3.8）0.05mL、0.5mL、1.0mL、2.5mL、10mL和25mL，置于50mL棕色容量瓶中，用40%乙腈溶液（3.5）定容至刻度，制得混合系列标准工作液，其中溴米索伐浓度依次为1.147μg/mL、11.466μg/mL、22.932μg/mL、57.330μg/mL、229.320μg/mL和573.300μg/mL，卡溴脲浓度依次为0.747μg/mL、7.470μg/mL、14.940μg/mL、37.350μg/mL、149.400μg/mL和373.500μg/mL；
3.11啫喱面霜试样。
4 仪器与设备
4.1高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 DAD二极管阵列检测器、Wookinglab色谱工作站；
4.2分析天平：精确到0.0001g；
4.3涡旋振荡器；
4.4超声波清洗机；
4.5离心机：转速不低于5000r/min；
4.6氮吹装置；
4.7容量瓶：10mL、50mL和100mL，棕色带刻度；
4.8具塞比色管：10mL，带刻度；
4.9具塞塑料离心管：10mL；
4.10 0.22μm微孔有机滤膜。
5 测定步骤
5.1 供试品溶液的制备
称取约1g（精确至0.001g）啫喱面霜试样（3.11），置于10mL具塞比色管（4.8）中，加入甲醇（3.2）溶解并定容至刻度，混匀，加入2g氯化钠（3.4）破乳，超声提取20min，冷却至室温。转移所得悬浮液5mL至具塞塑料离心管（4.9）中，5000r/min离心5min。取上清液1mL氮吹至干，用40%乙腈溶液（3.5）重新定容至1mL，经0.22μm微孔有机滤膜（4.10）过滤，取续滤液，待测。
5.2色谱条件
a）色谱柱：C18色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；
b）流动相：乙腈+水=40+60（体积比），等度洗脱；
c）流速：1.0mL/min；
d）进样量：10μL；
e）柱温：30℃；
f）检测器及检测波长：检测器为二极管阵列检测器，检测波长为210nm。
6 实验结果
6.1紫外光谱图的表征
按照上述色谱条件（5.2）进行采集，混合标准溶液（溴米索伐和卡溴脲的浓度依次为57.330μg/mL和37.350μg/mL）中溴米索伐和卡溴脲的紫外光谱图如图1所示。
图1溴米索伐和卡溴脲的紫外光谱图
6.2重复性测试
按照上述色谱条件（5.2）进行采集，混合标准溶液（溴米索伐和卡溴脲的浓度依次为57.330μg/mL和37.350μg/mL）的色谱图如图2所示，积分结果如表1所示。
图2溴米索伐和卡溴脲混合标准溶液的色谱图
表1溴米索伐和卡溴脲混合标准溶液色谱图积分结果
由表1中数据可知，溴米索伐和卡溴脲的分离度为13.51，可实现较好地分离；两者的理论塔板数分别为14956和17920，拖尾因子分别为1.12和1.09，均具有良好的峰形。
将混合标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图3所示，结果见表2。
图3混合标准溶液连续进样7针叠加的色谱图
表2混合标准溶液连续进样7针重复性数据统计
由表2中数据可知，将混合标准溶液连续进样7针进行重复性测试，溴米索伐保留时间的RSD为0.142%，峰面积的RSD为0.429%，卡溴脲保留时间的RSD为0.113%，峰面积的RSD为0.410%，均具有良好的定性定量重复性。
6.3仪器灵敏度测试
灵敏度测试的谱图如图4所示，计算结果见表3。
图4 仪器灵敏度的色谱图
表3仪器灵敏度测试数据
由表3中数据可知，溴米索伐的仪器检出限为0.014μg/mL，仪器定量限为0.046μg/mL，卡溴脲的仪器检出限为0.035μg/mL，仪器定量限为0.115μg/mL。
6.4含量测定
6.4.1校准曲线
按照色谱条件（5.2），将混合系列标准工作液（3.10）上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数如图5~图6所示。
图6卡溴脲的校准曲线
由图5~图6可知，溴米索伐和卡溴脲在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R2均＞0.999。混合系列标准工作液叠加的色谱图如图7所示。
图7混合系列标准工作液叠加的色谱图
6.4.2含量测定
以啫喱面霜作为试样，按照流程（5.1）对其进行处理，并进行加标回收实验。依据公式（1）计算啫喱面霜试样中溴米索伐和卡溴脲的含量。
式中：ω----为试样中溴米索伐/卡溴脲的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
C----为通过校准曲线得到的试样中溴米索伐/卡溴脲的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V----为试样的定容体积，单位为毫升（mL）；
m----为试样的质量，单位为克（g）；
1000----为单位换算系数。
试样的色谱图及试样加标的色谱图如图8~图9所示。
图8啫喱面霜试样的色谱图
图9啫喱面霜试样加标的色谱图
依据公式（1）进行计算，试样中未检测到溴米索伐和卡溴脲，溴米索伐的加标回收率为104.4%，卡溴脲的加标回收率为101.6%。
四、结论
通过对溴米索伐和卡溴脲的紫外光谱图、分离度、重复性、灵敏度、线性的测试以及对啫喱面霜试样中溴米索伐和卡溴脲的含量进行测定，实验结果表明：溴米索伐和卡溴脲的分离度为13.51，可实现较好地分离；两者的理论塔板数分别为14956和17920，拖尾因子分别为1.12和1.09，均具有良好的峰形；重复性测试中，将混合标准溶液连续进样7针，溴米索伐保留时间的RSD为0.142%，峰面积的RSD为0.429%，卡溴脲保留时间的RSD为0.113%，峰面积的RSD为0.410%，均具有良好的定性定量重复性；灵敏度测试中，溴米索伐的仪器检出限为0.014μg/mL，仪器定量限为0.046μg/mL，卡溴脲的仪器检出限为0.035μg/mL，仪器定量限为0.115μg/mL；溴米索伐和卡溴脲在测定浓度范围内均具有良好的线性关系，确定系数R2均＞0.999；对啫喱面霜试样进行测定，溴米索伐和卡溴脲均未检出，加标回收率分别为104.4和101.6%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪满足《GB/T 40899-2021 化妆品中禁用物质溴米索伐、卡溴脲和卡立普多的测定 高效液相色谱法》中溴米索伐和卡溴脲含量测定的需求。
附1：仪器配置清单
