一、 摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定连翘中连翘苷和连翘酯苷A的含量。本实验使用反相色谱，采用等度洗脱条件，实验结果：连翘苷和连翘酯苷A的理论塔板数分别为16605和13306；对照品溶液和供试品溶液重复性测试中，连翘苷和连翘酯苷A保留时间RSD的范围为0.157%~0.343%（n=7），峰面积RSD的范围为0.512%~0.799%（n=7）；以连翘苷计，两种青翘药材中含连翘苷分别为0.40%和1.28%；以连翘酯苷A计，两种青翘药材中含连翘脂苷A分别为2.74%和8.49%。因此，Wooking K2025可以满足连翘中连翘苷和连翘酯苷A含量测定的需求。

二、 背景

连翘为木犀科植物连翘的干燥果实，为《中国药典（2020年版）一部》收录的品种之一；功能主治清热解毒，消肿散结，疏散风热；用于痈疽，瘰疬，乳痈，丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋涩痛；具有抗微生物，抑制磷酸二酯酶、脂氧酶作用，镇吐，抗肝损伤，抗炎，抑制弹性蛋白酶活性，降低自发性高血压等功效。

连翘中含木脂素类、黄酮类、挥发性成分、苯乙烷类、乙基环己醇类、三萜类及香豆素类等化合物；还含有桦木酸、连翘苷、牛蒡子苷、罗汉松脂苷、松脂素、连翘醇苷C、连翘醇苷D等。连翘苷和连翘酯苷A是连翘中主要的活性成分。

三、 实验过程

1 范围

适用于连翘中连翘苷和连翘酯苷A的含量测定。

2 原理

连翘苷和连翘酯苷A为从连翘中提取的活性成分，连翘苷在277nm处有紫外吸收，连翘酯苷A在330nm处有紫外吸收，使用高效液相色谱法测定，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2 甲醇：色谱纯；

3.3 70%甲醇溶液：准确移取70mL甲醇（3.2）和30mL水（3.1），混匀；

3.4 乙腈：色谱级；

3.5 冰醋酸：色谱级；

3.6 0.4%冰醋酸溶液：准确量取冰醋酸（3.5）4mL，用水（3.1）溶解定容至1000mL，混匀；

3.7 连翘苷对照品：纯度为99.48%；

3.8 连翘酯苷A对照品：纯度为98.33%；

3.9 试验用样品：青翘药材，2个。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 分析天平：精确到0.0001g；

4.3 涡旋振荡器；

4.4 超声波清洗机；

4.5 离心机；

4.6 具塞锥形瓶：50mL；

4.7 容量瓶：10mL、25mL，棕色带刻度。

5 测定步骤

5.1 对照品溶液的配制

5.1.1对照品储备液的配制

精密称取连翘苷对照品（3.7）和连翘酯苷A对照品（3.8）各10mg，分别置于10mL棕色容量瓶中，加入甲醇（3.2）溶解并定容至刻度，摇匀，即得连翘苷和连翘酯苷A浓度均为1mg/mL的对照品储备液。

5.1.2对照品工作液的配制

连翘苷对照品工作液：用甲醇（3.2）将上述连翘苷对照品储备液稀释，制得每1mL含0.2mg连翘苷的对照品工作液。

连翘酯苷A对照品工作液：用甲醇（3.2）将上述连翘酯苷A对照品储备液稀释，制得每1mL含0.1mg连翘酯苷A的对照品工作液（临用配制）。

5.2 供试品溶液的制备

连翘苷的供试品溶液（供试品溶液1）：精密称取2种连翘粉末（3.9）各2 g（精确至0.001g），置于具塞锥形瓶（4.6）中，精密加入甲醇（3.2）25mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）25min，放冷，再称定重量，用甲醇（3.2）补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10mL，置于25mL容量瓶中，加水（3.1）稀释至刻度，摇匀，4000r/min条件下离心，滤过，取续滤液，即得。

连翘酯苷A的供试品溶液（供试品溶液2）：精密称取2种连翘粉末（3.9）各0.5g（精确至0.001g），置于具塞锥形瓶（4.6）中，精密加入70%甲醇（3.3）15mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，放冷，再称定重量，用70%甲醇（3.3）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5.3 色谱条件

（1）连翘苷的色谱条件

a）色谱柱: C₁₈，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：乙腈-水（25:75）；

c）流速：1.0mL/min；

d）进样量：10μL；

e）柱温：35℃；

f）检测器及检测波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为277nm。

（2）连翘酯苷A的色谱条件

a）色谱柱: C₁₈，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液（15:85）；

c）流速：0.6mL/min；

d）进样量：10μL；

e）柱温：35℃；

f）检测器及检测波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为330nm。

6 实验结果

6.1 对照品溶液的测定

按照上述色谱条件（5.3）分别进行采集，连翘苷对照品工作液（5.1.2）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

图1连翘苷对照品工作液的色谱图

表1 连翘苷对照品工作液积分结果

由表1中数据可知，连翘苷峰的理论塔板数为16605，满足《中国药典（2020年版）一部》中连翘苷峰理论塔板数不低于3000的要求；拖尾因子为1.03，具有良好的峰形。

连翘酯苷A对照品工作液（5.1.2）的色谱图如图2所示，积分结果如表2所示。

图2连翘酯苷A对照品工作液的色谱图

表2 连翘酯苷A对照品工作液积分结果

由表2中数据可知，连翘酯苷A峰的理论塔板数为13306，满足《中国药典（2020年版）一部》中连翘酯苷A峰理论塔板数不低于5000的要求；拖尾因子为0.94，具有良好的峰形。

将连翘苷对照品工作液连续进样7针，叠加色谱图如图3所示，结果如表3所示。

图3 连翘苷对照品工作液连续进样7针叠加的色谱图

表3 连翘苷对照品工作液连续进样7针重复性数据统计

由表3中数据可知，连翘苷对照品工作液连续进样7针重复性测试，保留时间的RSD为0.157%，峰面积的RSD为0.693%，具有良好的定性定量重复性。

将连翘酯苷A对照品工作液连续进样7针，叠加色谱图如图4所示，结果如表4所示。

图4 连翘酯苷A对照品工作液连续进样7针叠加的色谱图

表4 连翘酯苷A对照品工作液连续进样7针重复性数据统计

由表4中数据可知，连翘酯苷A对照品工作液连续进样7针重复性测试，保留时间的RSD为0.172%，峰面积的RSD为0.592%，具有良好的定性定量重复性。

6.2 供试品溶液的测定

选取两种不同产地的青翘药材（3.9），按照上述色谱条件（5.3）分别进行采集。

6.2.1连翘苷供试品溶液的测定

青翘1#提取液（供试品溶液1）的色谱图如图5所示，青翘2#提取液（供试品溶液2）的色谱图如图6所示。

图5青翘1#提取液（供试品溶液1）的色谱图

图6青翘2#提取液（供试品溶液2）的色谱图

青翘药材中连翘苷的含量按公式（1）进行计算。

式中：X——为试样中连翘苷的含量，单位为百分数（%）；

C₁——为根据连翘苷对照品工作液计算得到的供试品溶液中连翘苷的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

S₁——为连翘苷对照品工作液中连翘苷的峰面积，单位为mAU.s；

S_i——为连翘苷供试品溶液中连翘苷的峰面积，单位为mAU.s；

V_i——为定容体积，单位为毫升（mL）；

t——为稀释倍数；

m——为试样的称样量，单位为克（g）；

1000、100——换算系数。

依据公式（1）进行计算，青翘1#中连翘苷的含量为0.40%，青翘2#中连翘苷的含量为1.28%，《中国药典（2020年版）一部》中规定，连翘按干燥品计算，含连翘苷不得少于0.15%，故这两种青翘药材均满足药典规定。

将青翘1#提取液（供试品溶液1）连续进样7针，叠加色谱图如图7所示，结果如表5所示。

图7 青翘1#提取液（供试品溶液1）连续进样7针叠加的色谱图

表5 青翘1#提取液（供试品溶液1）连续进样7针重复性数据统计

由表5中数据可知，青翘1#提取液（供试品溶液1）连续进样7针重复性测试，保留时间的RSD为0.179%，峰面积的RSD为0.653%，具有良好的定性定量重复性。

将青翘2#提取液（供试品溶液2）连续进样7针，叠加色谱图如图8所示，结果如表6所示。

图8 青翘2#提取液（供试品溶液2）连续进样7针叠加的色谱图

表6 青翘2#提取液（供试品溶液2）连续进样7针重复性数据统计

由表6中数据可知，青翘2#提取液（供试品溶液2）连续进样7针重复性测试，保留时间的RSD为0.162%，峰面积的RSD为0.512%，具有良好的定性定量重复性。

6.2.2连翘酯苷A供试品溶液的测定

青翘1#提取液（供试品溶液1）的色谱图如图9所示，青翘2#提取液（供试品溶液2）的色谱图如图10所示。

图9青翘1#提取液（供试品溶液1）的色谱图

图10青翘2#提取液（供试品溶液2）的色谱图

青翘药材中连翘酯苷A的含量按公式（2）进行计算。

式中：Y——为试样中连翘酯苷A的含量，单位为百分数（%）；

C₂——为根据连翘酯苷A对照品工作液计算得到的供试品溶液中连翘酯苷A的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

S₂——为连翘酯苷A对照品工作液中连翘酯苷A的峰面积，单位为mAU.s；

S_j——为连翘酯苷A供试品溶液中连翘酯苷A的峰面积，单位为mAU.s；

V_j——为定容体积，单位为毫升（mL）；

m——为试样的称样量，单位为克（g）；

1000、100——为换算系数。

依据公式（2）进行计算，青翘1#中连翘酯苷A的含量为2.74%，青翘2#中连翘酯苷A的含量为8.49%，《中国药典（2020年版）一部》中规定，按干燥品计算，青翘含连翘酯苷A不得少于3.5%，因此青翘1#不合格，青翘2#合格。

将青翘1#提取液（供试品溶液1）连续进样7针，叠加色谱图如图11所示，结果如表7所示。

图11青翘1#提取液（供试品溶液1）连续进样7针叠加的色谱图

表7 青翘1#提取液（供试品溶液1）连续进样7针重复性数据统计

由表7中数据可知，青翘1#提取液（供试品溶液1）连续进样7针重复性测试，保留时间的RSD为0.224%，峰面积的RSD为0.799%，具有良好的定性定量重复性。

将青翘2#提取液（供试品溶液2）连续进样7针，叠加色谱图如图12所示，结果如表8所示。

图12青翘2#提取液（供试品溶液2）连续进样7针叠加的色谱图

表8 青翘2#提取液（供试品溶液2）连续进样7针重复性数据统计

由表8中数据可知，青翘2#提取液（供试品溶液2）连续进样7针重复性测试，保留时间的RSD为0.343%，峰面积的RSD为0.722%，具有良好的定性定量重复性。

7 结论

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定连翘中连翘苷和连翘酯苷A的含量。本实验使用反相色谱，采用等度洗脱条件，实验结果表明，连翘苷和连翘酯苷A的理论塔板数分别为16605和13306，均满足《中国药典（2020年版）一部》中对目标物理论塔板数的要求；连翘苷对照品工作液重复性测试中，保留时间的RSD为0.157%（n=7），峰面积的RSD为0.693%（n=7）；连翘酯苷A对照品工作液重复性测试中，保留时间的RSD为0.172%（n=7），峰面积的RSD为0.592%（n=7），均具有良好的定性定量重复性；两种青翘药材供试品溶液连续进样7针，连翘苷保留时间的RSD分别为0.179%和0.162%，峰面积的RSD分别为0.653%和0.512%；连翘酯苷A保留时间的RSD分别为0.224%和0.343%，峰面积的RSD分别为0.799%和0.722%，均具有良好的定性定量重复性；以连翘苷计，青翘1#的含量为0.40%，青翘2#的含量为1.28%，两种青翘药材中连翘苷的含量均满足《中国药典（2020年版）一部》的要求；以连翘酯苷A计，青翘1#的含量为2.74%，青翘2#的含量为8.49%，其中青翘1#不合格，青翘2#合格。因此，Wooking K2025可以满足连翘中连翘苷和连翘酯苷A含量测定的需求。

附1：仪器配置清单