一、摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定客户样品中羟基乙酸的含量。色谱条件：C₁₈ 色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为0.8mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL，检测波长为218nm。实验结果：羟基乙酸的理论塔板数为9748；羟基乙酸的仪器检出限为0.002 mg/mL，仪器定量限为0.005 mg/mL；羟基乙酸在测定浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R²＞0.9999；样品1中羟基乙酸的含量为0.11mg/mL，样品2中羟基乙酸的含量为17.75mg/mL，样品3中羟基乙酸的含量为1.93mg/mL，样品4中羟基乙酸的含量为70.10mg/mL，样品5中未检出羟基乙酸。对样品5进行加标实验，加标回收率为97.5%。

二、实验过程

1 原理

羟基乙酸在218nm处有紫外吸收，使用高效液相色谱法测定，外标法定量。

2 试剂与材料

2.1水：符合GB/T 6682的一级水；

2.2甲醇（CH₃OH）：色谱纯；

2.3磷酸（H₃PO₄）：色谱纯；

2.4磷酸水溶液（pH=3.00）：量取1L水，用磷酸（2.3）调pH至3.00；

2.5溶剂：甲醇+磷酸水溶液（pH=3.00）=20+80，将10mL甲醇（2.2）与40mL磷酸水溶液（pH=3.00）（2.4）混合，摇匀备用；

2.6羟基乙酸标准品：客户提供；

2.7样品1~样品5；客户提供。

3 仪器与设备

3.1高效液相色谱仪：

具体配置包括：

Wooking K2025 P2二元高压输液泵（脱气机、四通道溶剂切换阀、自动在线清洗系统）；

Wooking K2025 AS自动进样器（脱气组件、50μL定量环）；

Wooking K2025 CO柱温箱（室温以下10℃至85℃）；

Wooking K2025 UVD紫外-可见光检测器；

Wookinglab色谱工作站（中文版）。

3.2涡旋振荡器；

3.3超声波清洗机；

3.4 pH计：精确到0.01 pH单位。

4 测定步骤

4.1标准溶液配制

4.1.1标准储备液配制

称取一定量羟基乙酸标准品（2.6），用溶剂（2.5）溶解，配制成浓度为10mg/mL的标准储备液。

4.1.2标准系列溶液配制

分别取一定量的标准储备液，用溶剂（2.5）溶解，配制成浓度依次为0.1mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0mg/mL、2.0 mg/mL、5.0 mg/mL的标准系列溶液。

4.2色谱条件

a）色谱柱：ChromCore AQ C₁₈ ，4.6×250mm，5μm；

b）流动相：甲醇（2.2）为流动相A，磷酸水溶液（pH=3.00）（2.4）为流动相B，等度洗脱：A:B=20:80;

c）进样量：10μL；

d）柱温：25℃；

e）检测器及波长：紫外-可见光检测器，波长设置为218nm。

5 样品测试结果

5.1 校准曲线

将标准系列溶液（4.1.2）由低浓度至高浓度注入高效液相色谱仪，按色谱条件（4.2）进行采集，得到不同浓度目标化合物的色谱图，记录保留时间和峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立校准曲线。羟基乙酸（浓度为1.0mg/mL）的标准色谱图见图1，积分结果见表1。羟基乙酸（浓度为0.1 mg/mL）的仪器灵敏度色谱图见图2，灵敏度测试结果见表2。

 

图1 羟基乙酸（浓度为1.0mg/mL）的标准色谱图

表1 羟基乙酸（浓度为1.0mg/mL）色谱图积分结果

由表1中数据可知，羟基乙酸的理论塔板数为9748。

 

 

图2 仪器灵敏度的色谱图

 

 

 

 

 

表2仪器灵敏度测试数据

 

由表2中数据可知，羟基乙酸的仪器检出限为0.002 mg/mL，仪器定量限为0.005 mg/mL。

线性方程和确定系数等指标如图3所示。由图3可知，羟基乙酸在测定浓度范围内线性关系良好，确定系数R²＞0.9999，羟基乙酸标准系列溶液叠加的色谱图如图4所示。

 

图3 羟基乙酸的校准曲线 

 

图4 羟基乙酸标准系列溶液叠加的色谱图

5.2含量测定

分别取样品1~样品4适量，用溶剂（2.5）稀释10倍，待测；取样品5适量，用溶剂（2.5）配制成羟基乙酸含量为1.0mg/mL的样品测试液。将样品1~样品5测试液按色谱条件（4.2）进行测定，并对样品5做加标回收实验。空白溶液的色谱图、样品1~样品5的色谱图及样品5加标的色谱图如图5~图11所示。

 

图5 空白溶液的色谱图

 

图6 样品1的色谱图

 

图7 样品2的色谱图

 

图8 样品3的色谱图

 

图9 样品4的色谱图

 

图10 样品5的色谱图

 

图11 样品5加标的色谱图

由羟基乙酸校准曲线计算样品1~样品5测试液及样品5加标测试液中羟基乙酸的含量，结果见表3。

表3 样品1~样品5测试液及样品5加标测试液中羟基乙酸的含量结果表

依据表3中数据计算可知，样品1中羟基乙酸的含量为0.11mg/mL，样品2中羟基乙酸的含量为17.75mg/mL，样品3中羟基乙酸的含量为1.93mg/mL，样品4中羟基乙酸的含量为70.10mg/mL，样品5中未检出羟基乙酸，样品5加标回收率为97.5%。

三、结论

本实验对客户提供的样品中的羟基乙酸的含量进行测定，结果表明：羟基乙酸的理论塔板数为9748；羟基乙酸的仪器检出限为0.002mg/mL，仪器定量限为0.005 mg/mL；羟基乙酸在测定浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R²＞0.9999；样品1中羟基乙酸的含量为0.11mg/mL，样品2中羟基乙酸的含量为17.75mg/mL，样品3中羟基乙酸的含量为1.93mg/mL，样品4中羟基乙酸的含量为70.10mg/mL，样品5中未检出羟基乙酸。对样品5进行加标实验，加标回收率为97.5%。