【悟空FUN学】液相色谱方法开发攻略：从理论到实战，3大核心 + 4个实例教会你！

对于众多科研人而言，液相色谱方法开发这块“硬骨头”没少给大家添堵。“到底怎样才能快速开发出稳定可靠的 HPLC 方法呢？”好不容易完成初步开发，却又被分离度问题绊住脚：“分离度达不到要求，究竟该怎么调整？”

曾经，液相色谱方法开发宛如一门神秘莫测的玄学，但深入探究后便会发现，只要掌握核心逻辑，再搭配上切实可行的实战技巧，高效搞定方法开发并非遥不可及。

今天，我们就结合《中国药典（2025 年版）》以及实际案例，为大家呈上一套从理论到落地执行的完整攻略，助力各位攻克方法开发难题。

1、先搞懂：液相方法开发的核心基础

什么是 “靠谱” 的液相方法？

一套完整的 HPLC 方法，核心是明确 8 大关键参数，包括：流动相（种类、比例、梯度 / 等度）、流速、进样量、色谱柱（类型、尺寸）、柱温、检测波长、采集时间、灵敏度。而评价方法是否合适的核心指标之一，就是分离度（Rs） —— 待测峰与相邻峰的分离程度。《中国药典（2025年版）》中要求，除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5，关键分离场景建议≥2.0。

分离度的 “3大影响因子”

分离度的本质由 3 个参数决定，公式清晰可见：

1）柱效（N）：反映色谱峰展宽程度，塔板数越多，峰越窄；

2）选择性（α）：组分间分离的关键化学因素，影响最大；

3）保留因子（k）：组分与柱填料的作用强度，一般理想范围：1~10。

其中选择性（α）是改善分离度的最有效手段，微小调整就能带来显著变化。

2、实战技巧：快速优化分离效果的关键手段

调整保留因子（k）：优化保留时间

1）反相色谱：增加有机相比例（如乙腈、甲醇），k 值减小，保留时间缩短；

2）正相 / 离子对色谱：类似反相逻辑，调整极性溶剂比例即可；

3）离子交换色谱：提高缓冲盐浓度，增强离子强度，k 值减小；

4）通用方法：调节流动相 pH、梯度淋洗斜率，快速找到合适保留范围。

优化选择性（α）：搞定 “难分离峰”

1）换色谱柱：尝试不同类型色谱柱（如不同固定相材质、粒径、长度、内径等）是改变 α 的直接方式。

2）调流动相：更换有机相类型（乙腈→甲醇）、添加离子对试剂（辛烷磺酸盐）或缓冲盐（醋酸盐、柠檬酸盐）；

3）改温度：柱温每升高 1℃，保留值约减 1%~2%，还能改变组分分离特性；

4）特殊手段：添加三乙胺（抑制碱性物质峰拖尾）、乙酸（改善酸性物质峰形）。

提升柱效（N）：使峰形更尖锐

1）选小粒径色谱柱：减小填料粒径，增加塔板数；

2）调流速：降低流速可提升柱效，但需平衡分析时间；

3）控温度：适当升温降低流动相黏度，减少峰展宽；

4）优化进样：减小进样体积，避免过载导致峰形扩散。

3、4个真实案例：手把手教你落地

案例1 小蓟配方颗粒特征图谱 —— 色谱柱筛选是关键

在《中国药典（2025年版）》中，方法普适性得到了提升，不再限定色谱柱的品牌和型号，那么，在方法开发中，色谱柱的筛选是非常重要的一环。以下是小蓟配方颗粒特征图谱的案例，标准中要求采用C₁₈色谱柱，而悟空仪器拥有多款型号的C₁₈色谱柱，哪款更适合呢？我们对JinGuBang 120-5-C₁₈、JinGuBang 120-5-C₁₈(AR)、JinGuBang 180-5-C₁₈(AQ)、JinGuBang PAH这四款类型的色谱柱进行了考察，详情如下：

色谱条件：

流动相：以乙腈为流动相A，以0.1 %磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；

进样量：10 μL；

柱温：25 ℃；

检测器及检测波长：紫外-可见光检测器，检测波长为340 nm。

峰1：新绿原酸；峰2（S1）：绿原酸；峰3：隐绿原酸；峰4：咖啡酸；峰5：芦丁；峰8（S2)：蒙花苷

经过筛选，我们发现120-5-C18的特征峰均有良好保留，且相对保留时间和相对峰面积均满足标准要求。

相对保留时间结果表

相对峰面积结果表

案例2 蜂蜜中 5 种糖测定 —— “特殊手段”的妙用

用户在对蜂蜜中的5种糖类成分（果糖、葡萄糖、蔗糖、松二糖和麦芽糖）进行检测分析时，遇到了分离难题。由于果糖和葡萄糖属于单糖异构体，而蔗糖、松二糖和麦芽糖则是二糖类异构体，它们在色谱柱上的分离难度较大。尽管用户多次尝试调整实验条件，例如改变柱温箱的温度以及流动相的流速，但蔗糖和松二糖的分离效果始终未能达到预期要求。

之后，用户联系了悟空应用实验室寻求技术支持。应用工程师凭借丰富的经验，建议客户在流动相中添加0.1%的氨水。这一调整旨在通过强化糖同分异构体之间的构象差异，来提升它们的分离效果。按照工程师的建议操作后，色谱分离度得到了显著改善，成功满足了用户的检测要求。