背景：

羟甲基糠醛是蜂蜜中的还原糖经加热、脱水生成的一种黑色具有难闻气味的有毒物质，其反应机理是在酸性条件下，蜂蜜中的氨基化合物与葡萄糖发生Mailard反应或者蜂蜜中的还原糖发生脱水反应，生成羟甲基糠醛。

新鲜蜂蜜中羟甲基糠醛的含量很低，一般不会超过10mg/kg。但在加工和贮藏过程中其含量将逐渐增高，甚至可能超标。羟甲基糠醛的存在会严重影响到蜂蜜食用的安全性，对眼睛、黏膜或皮肤有刺激性，摄入过多会引起中毒，甚至引发癌症、造成动物横纹肌麻痹和内脏损伤。

在国际贸易中羟甲基糠醛属强检指标，要求每千克蜂蜜中羟甲基糠醛的含量应小于40mg。各国也规定了羟甲基糠醛的最高限量，并将之作为判定是否掺有转化糖的依据。

实验部分：

仪器与试剂：

仪器与设备：悟空K2025高效液相色谱仪；分析天平（精确到0.0001g）；涡旋振荡器；pH计；容量瓶（10mL、1000mL，棕色带刻度）等。

试剂与材料：羟甲基糠醛标准品（CAS号:67-47-0，纯度为99.9%）；符合GB/T6682的一级水；甲醇（色谱纯）；0.22µm微孔滤膜（有机相）。

实验方法：

样品处理：称取10g蜂蜜试样（精确至0.01g），置于100mL烧杯中，加入10 mL甲醇，用玻璃棒轻轻搅拌均匀，使试样完全溶解。将上述溶液转移至100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，充分混匀。该溶液用0.22μm的滤膜过滤，取续滤液待上机测定。

色谱条件：

a）色谱柱: C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）

b）流动相：甲醇+水（10＋90）

c）柱温：30℃

d）进样量：10μL

e）流速：1.0mL/min

f）波长：285nm

【结果与讨论】：

1. 羟甲基糠醛标准溶液（浓度为2.040µg/mL）色谱图如图1所示：

图1 羟甲基糠醛标准溶液色谱图

2. 将羟甲基糠醛标准溶液逐级稀释至信噪比S/N为3左右，计算仪器的检出限，数据结果见表1。经计算仪器针对羟甲基糠醛的检出限为0.014µg/mL，定量限为0.048µg/mL。

表1灵敏度测试数据

3. 将系列羟甲基糠醛标准溶液在HPLC上进行测定，绘制校准曲线，线性方程及相关系数见图2，曲线的相关系数R²为0.9999，线性关系良好；系列浓度溶液色谱图如图3所示。

图2 羟甲基糠醛标准溶液校准曲线

图3羟甲基糠醛系列浓度标准溶液色谱图

4. 购买市售蜂蜜样品进行处理，并进行加标回收实验，样品加标回收色谱图如图4所示，羟甲基糠醛加标回收率为95.2%。

图4 蜂蜜样品加标回收色谱图

【结论】

通过对羟甲基糠醛的色谱峰型、重复性、灵敏度、线性测试以及对蜂蜜样品测试，表明使用K2025高效液相色谱仪测定蜂蜜样品中羟甲基糠醛具有良好的线性关系，确定系数R²值为0.9999；连续进样7针，保留时间的RSD值为0.031%，峰面积的RSD值为0.489%，定性定量均有良好的重复性；羟甲基糠醛的仪器检出限为0.014µg/mL，定量限为0.048µg/mL，加标回收率为95.2%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪完全可以满足《GB/T 18932.18-2003 蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法 液相色谱-紫外检测法》测定羟甲基糠醛含量的需求。