一、摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定大豆卵磷脂类食品中磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）三种物质的含量。色谱条件：硅胶柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.2mL/min，进样量为10μL，柱温为20℃，检测波长为208nm。实验结果：在连续进样7针的重复性测试中，磷脂酰乙醇胺保留时间的RSD为0.075%，峰面积的RSD为1.044%；磷脂酰肌醇保留时间的RSD为0.498%，峰面积的RSD为1.682%；磷脂酰胆碱保留时间的RSD为0.121%，峰面积的RSD为1.608%；磷脂酰乙醇胺的仪器检出限为0.008mg/mL，仪器定量限为0.027mg/mL；磷脂酰肌醇的仪器检出限为0.009mg/mL，仪器定量限为0.030mg/mL；磷脂酰胆碱的仪器检出限为0.015mg/mL，仪器定量限为0.052mg/mL；对市面上购买的大豆卵磷脂试样进行测定，平行测定的两次结果中，磷脂酰乙醇胺的含量分别为394.3mg/g和387.0mg/g，磷脂酰肌醇的含量分别为103.5mg/g和100.8mg/g，磷脂酰胆碱的含量分别为100.6mg/g和98.4mg/g。

二、背景

 本实验在国家标准《GB 5009.272-2016 食品中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的测定》的基础上，对实验方法适当调整，完成对于三种物质的同时检测。

磷脂酰胆碱有时候也被称之为卵磷脂，是由法国科学家最早在蛋黄中提取而来；磷脂酰胆碱是生物膜的重要组成部分，也是动物和植物组织内棕色脂肪的组成部分；磷脂酰胆碱是细胞间传递信号的物质。

磷脂酰乙醇胺一般指脑磷脂，是一种优良的天然活性剂，主要存在于脑、神经、大豆等中，磷脂酰乙醇胺不溶于水和丙酮，微溶于乙醇，溶于氯仿和乙醚。磷脂酰乙醇胺的主要提取方式一般可以由刚被宰杀的畜牧的新鲜大脑或大豆中提取。

磷脂酰肌醇是由两个部分，磷酸1，2-二酯酰甘油和肌醇构成。在细胞中对于细胞形态、代谢调控、信号传到等细胞的各项功能有着密不可分的关系；是G蛋白偶联受体的信号转导通路中的一种途径。

三、实验过程

1 范围

适用于大豆卵磷脂类食品中磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）三种物质的含量测定。

2原理

磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）经？提取后，在208nm处有紫外吸收，采用高效液相色谱法测定，使用外标法计算含量。

3 试剂与材料

3.1水：符合GB/T6682的一级水；

3.2 正己烷：色谱纯；

3.3 异丙醇：色谱纯；

3.4 乙酸：色谱纯；

3.5 乙酸水溶液：吸取1.4mL（3.4）乙酸至100mL容量瓶中，用水（3.1）定容至刻度，摇匀；

3.6流动相：正己烷（3.2）-异丙醇（3.3）-乙酸水溶液（3.5）=（800:800:92）；

3.7 磷脂酰乙醇胺对照品：CAS号：39382-08-06，纯度98.0%；

3.8 磷脂酰肌醇对照品：CAS号：97281-52-2，纯度79.8%；

3.9 磷脂酰胆碱对照品：CAS：号8002-43-5，纯度98.0%；

3.10 大豆卵磷脂样品。                                                              

4 仪器与设备

4.1高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2分析天平：精确到0.0001g；

4.3 涡旋振荡器；

4.4 容量瓶：5mL、100mL（棕色带刻度）；

4.5移液器；

4.6 0.22μm微孔有机滤膜。

5 测定步骤

5.1 溶液配制

5.1.1 标准品储备液配制（线性5）：称取磷脂酰乙醇胺对照品（3.7）10.4mg、磷脂酰肌醇对照品（3.8）4.8mg、磷脂酰胆碱对照品（3.9）9.6mg，分别置于5mL容量瓶中，使用流动相（3.6）定容至刻度。（磷脂酰乙醇胺浓度约为2mg/mL，磷脂酰肌醇的浓度约为1mg/mL，磷脂酰胆碱的浓度约为2mg/mL）。

5.1.2 标准品溶液配置：

线性1：分别准确移取5.1.1储备液0.125mL，使用流动相（3,6）定容至2.5mL（磷脂酰乙醇胺的浓度0.10mg/mL，磷脂酰肌醇的浓度为0.05mg/mL，磷脂酰胆碱浓度为0.10mg/mL）。

线性2：分别准确移取5.1.1储备液0.625mL，使用流动相（3,6）定容至2.5mL（磷脂酰乙醇胺的浓度0.50mg/mL，磷脂酰肌醇的浓度为0.25mg/mL，磷脂酰胆碱浓度为0.50mg/mL）。

线性3：分别准确移取5.1.1储备液1.250mL，使用流动相（3,6）定容至2.5mL（磷脂酰乙醇胺的浓度1.00mg/mL，磷脂酰肌醇的浓度为0.50mg/mL，磷脂酰胆碱浓度为1.00mg/mL）。

线性4：分别准确移取5.1.1储备液1.875mL，使用流动相（3,6）定容至2.5mL（磷脂酰乙醇胺的浓度1.50mg/mL，磷脂酰肌醇的浓度为0.75mg/mL，磷脂酰胆碱浓度为1.50mg/mL）。

密封后，放置于-20℃冰箱中保存备用。

5.1.2样品溶液制备：分别称取大豆卵磷脂样品（3.10）15.8g（样品1）、18.5g（样品2），分别置于5mL容量瓶中，加入适量流动相（3.6）溶解并定容至刻度，使用0.22μm微孔有机滤膜过滤。密封后，放置于-20℃冰箱中保存备用。

 

5.2色谱条件

a）色谱柱：硅胶柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：详见3.6；

c）流速：1.2mL/min；

d）进样量：10μL；

e）柱温：20℃；

f）检测器及波长：紫外-可见光检测器，检测波长为208nm。

6 要求

大豆卵磷脂样品，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值5%。

7 实验结果

7.1 重复性测试

按照上述色谱条件（5.2）进行采集，混合标准溶液（线性3）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

图1混合标准溶液（线性3）的色谱图

表1混合标准溶液（线性3）的色谱图积分结果

将混合标准溶液（线性3）连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

 

 

图2混合标准溶液（线性3）叠加的色谱图

表2 混合标准溶液（线性3）连续进样7针重复性数据统计

 

将混合标准溶液（线性3）连续进样7针进行重复性测试，磷脂酰乙醇胺保留时间的RSD为0.075%，峰面积的RSD为1.044%；磷脂酰肌醇保留时间的RSD为0.498%，峰面积的RSD为1.682%；磷脂酰胆碱保留时间的RSD为0.121%，峰面积的RSD为1.608%，均具有良好的定性定量重复性。

7.2 灵敏度测试

灵敏度测试的色谱图如图3所示，计算结果见表3。

 

图3 仪器灵敏度的色谱图

表3 仪器灵敏度测试数据

由表3中数据可知，磷脂酰乙醇胺的仪器检出限为0.008mg/mL，仪器定量限为0.027mg/mL； 磷脂酰肌醇的仪器检出限为0.009mg/mL，仪器定量限为0.030mg/mL；磷脂酰胆碱的仪器检出限为0.015mg/mL，仪器定量限为0.052mg/mL。

7.3含量测定

7.3.1 校准曲线

按照上述色谱条件（5.2）进行采集，将磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数结果如图4~图6所示。

 

图4磷脂酰乙醇胺校准曲线

 

 

图5磷脂酰肌醇胺校准曲线

 

图6磷脂酰胆碱校准曲线

由图4~图6可知，磷脂酸乙醇胺（PC），磷脂酸肌醇（PE）和磷脂酸胆碱（PI）在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R²在0.999以上，标准系列工作液叠加的色谱图如图7所示。

 

图7标准系列工作液叠加色谱图

7.3.2含量测定

按照5.1.2的处理方式对市售大豆卵磷脂样品进行处理。依据公式（1）进行计算，大豆卵磷脂样品的色谱图如图8和图9所示。

式中：ω----试样中磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺/磷脂酰肌醇的含量，单位为毫克每克（mg/g）；

      P----从标准工作曲线上得到的目标组分（磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇）的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；

V----试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；

m----试样质量，单位为克（g）；

K----稀释倍数（大豆卵磷脂为1、植物油类为5）。

大豆卵磷脂样品计算结果保留至小数点后一位。

 

图8 大豆卵磷脂样品1的色谱图

 

图9大豆卵磷脂样品2的色谱图

 

 

由公式（1）计算大豆卵磷脂样品中磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱的含量，结果如表4所示。两次平行测试中，磷脂酰乙醇胺的含量分别为394.3mg/g和387.0mg/g，磷脂酰肌醇的含量分别为103.5mg/g和100.8mg/g，磷脂酰胆碱的含量分别为100.6mg/g和98.4mg/g，两次独立测定结果的绝对差值均未超过算数平均值5%。

表4 样品中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱的含量结果表

 

8 结论

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定大豆卵磷脂类食品中磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）三种物质的含量。其中，磷脂酰乙醇胺的理论塔板数为1653，拖尾因子为1.53；磷脂酰肌醇的理论塔板数为742，分离度未7.91，拖尾因子为0.88；磷脂酰胆碱的理论塔板数为1165，拖尾因子为7.06，拖尾因子为1.30。在连续进样7针的重复性测试中，磷脂酰乙醇胺保留时间的RSD为0.075%，峰面积的RSD为1.044%；磷脂酰肌醇保留时间的RSD为0.498%，峰面积的RSD为1.682%，磷脂酰胆碱保留时间的RSD为0.121%，峰面积的RSD为1.608%，均具有良好的定性定量重复性；磷脂酰乙醇胺的仪器检出限为0.008mg/mL，仪器定量限为0.027mg/mL； 磷脂酰肌醇的仪器检出限为0.009mg/mL，仪器定量限为0.030mg/mL；磷脂酰胆碱的仪器检出限为0.015mg/mL，仪器定量限为0.052mg/mL。对市面上购买的大豆卵磷脂进行测定，两次平行测定的结果中，磷脂酰乙醇胺的含量分别为394.3mg/g和387.0mg/g，磷脂酰肌醇的含量分别为103.5mg/g和100.8mg/g，磷脂酰胆碱的含量分别为100.6mg/g和98.4mg/g，两次独立测定结果的绝对差值均未超过算数平均值5%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪满足对食物中磷脂酰乙醇胺，磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇测定的需求。