一、摘要

本文使用Wooking K2025高效液相色谱仪测定乳粉中抗坏血酸的含量。色谱条件：C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为0.7mL/min，柱温为25℃，进样量为20μL，检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为245nm。实验结果：L（+）-抗坏血酸的理论塔板数为10816，D（-）-抗坏血酸的理论塔板数为11070，L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸的分离度为1.83；重复性测试中，抗坏血酸混合标准溶液连续进样7针，L（+）-抗坏血酸保留时间的RSD为0.203%，峰面积的RSD为0.501%；D（-）-抗坏血酸保留时间的RSD为0.222%，峰面积的RSD为0.300%；L（+）-抗坏血酸的仪器检出限为0.015μg/mL，仪器定量限为0.049μg/mL；D（-）-抗坏血酸的仪器检出限为0.017μg/mL，仪器定量限为0.056μg/mL；L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R2均在0.999以上；对乳粉试样进行测定，L（+）-抗坏血酸的含量为61mg/100g，D（-）-抗坏血酸未检出，L（+）-抗坏血酸总量为59mg/100g，抗坏血酸的加标回收率范围为75.2%~81.2%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪满足《GB 5009.86-2016 食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定（第一法）》乳粉中抗坏血酸含量测定的需求。

二、背景

抗坏血酸可分为L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸。L（+）-抗坏血酸，又称为维生素C，是一种天然存在的具有抗氧化性质的有机化合物，也是一种维持人体正常活动不可缺少的营养物质。D（-）-抗坏血酸常作为抗氧化剂、防腐剂、发色助剂用于食品工业，但摄入过多也会使白细胞的抗病能力明显下降，会引起尿酸结石、腹泻、多尿及皮疹等。因此，分离并同时测定乳粉中L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸具有重要意义。

三、实验过程

1 范围

适用于乳粉中抗坏血酸的含量测定。

2原理

试样中的抗坏血酸用偏磷酸溶解、超声提取后，以磷酸盐为流动相，经反相色谱柱分离，其中L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸直接用配有紫外检测器的液相色谱仪（波长245nm）测定；试样中的L（+）-脱氢抗坏血酸经L-半胱氨酸溶液进行还原后，用紫外检测器（波长245nm）测定L（+）-抗坏血酸总量，或减去原样品中测得的L（+）-抗坏血酸含量而获得L（+）-脱氢抗坏血酸的含量。以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2 偏磷酸（HPO3）n：含量（以HPO3计）≥38%；

3.3 偏磷酸溶液（200g/L）：称取200g（精确至0.1g）偏磷酸（3.2），溶于水并稀释至1L；

3.4 偏磷酸溶液（20g/L）：量取50mL 200g/L偏磷酸溶液（3.3），用水稀释至500mL；

3.5 磷酸三钠（Na3PO4·12H2O）；

3.6偏磷酸三钠溶液（100g/L）：称取100g（精确至0.1g）磷酸三钠（3.5），溶于水并稀释至1L；

3.7 磷酸二氢钾（KH2PO4）：分析纯；

3.8 磷酸（H3PO4）：色谱纯；

3.9 L-半胱氨酸（C3H7NO2S）：分析纯；

3.10 L-半胱氨酸溶液（40g/L）：称取4g L-半胱氨酸（3.9），溶于水并稀释至100mL；

3.11甲醇（CH3OH）：色谱纯；

3.12 L（+）-抗坏血酸标准品（C6H8O6），纯度≥99%；

3.13 D（-）-抗坏血酸（异抗坏血酸）标准品（C6H8O6），纯度≥99%；

3.14 L（+）-抗坏血酸标准储备液（1.000 mg/mL）：准确称取适量L（+）-抗坏血酸标准品（3.12），用20g/L的偏磷酸溶液（3.4）稀释配制成浓度为1.000 mg/mL 的L（+）-抗坏血酸标准储备液；

3.15 D（-）-抗坏血酸标准储备液（1.000 mg/mL）：准确称取适量D（-）-抗坏血酸标准品（3.13），用20g/L的偏磷酸溶液（3.4）稀释配制成浓度为1.000 mg/mL 的D（-）-抗坏血酸标准储备液；

3.16 抗坏血酸混合标准系列工作液：分别移取一定量的 L（+）-抗坏血酸标准储备液（3.14）和D（-）-抗坏血酸标准储备液（3.15），用20g/L的偏磷酸溶液（3.4）稀释配制成浓度分别为0μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL的混合标准系列工作液；

3.17 流动相：A：6.8g磷酸二氢钾（3.7），用水溶解并定容至1L，用磷酸（3.8）调pH至2.5~2.8；B：100%甲醇。按A:B=98:2混合，过0.45μm滤膜，超声脱气。

4 仪器与设备

4.1高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2分析天平：精确到0.0001g；

4.3 超声波清洗机；

4.4 pH计：精度为0.01；

4.5离心机：转速≥4000r/min；

4.6 真空抽滤装置；

4.7 塑料离心管：50 mL，材质为聚丙烯；

4.8 容量瓶：10mL、50mL，棕色带刻度；

4.9 烧杯：50mL；

5.0 滤膜：水相，0.45μm。

5 测定步骤

整个检测过程尽可能在避光条件下进行。

5.1 试样溶液的制备

称取乳粉试样2g（精确至0.001g）于50mL烧杯（4.9）中，用20g/L的偏磷酸溶液（3.4）将试样转移至50mL容量瓶中，振摇溶解并定容。摇匀，全部转移至50mL离心管中，超声提取5min后，于4000r/min离心5min，取上清液过0.45μm水相滤膜，滤液待测[由此试液可同时分别测定试样中L（+）-抗坏血酸和D（-）-异抗坏血酸的含量] 。

5.2 试样溶液的还原

准确吸取20mL上述离心后的上清液（5.1）于50mL离心管中，加入10mL 40g/L的L-半胱氨酸溶液（3.10），用100g/L的磷酸三钠溶液（3.6）调节pH至7.0~7.2，以200次/min振荡5min。再用磷酸（3.8）调节pH至2.5~2.8，用水将试液全部转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。混匀后取此试液过0.45μm水相滤膜后待测[由此试液可测定试样中包括脱氢型的L（+）-抗坏血酸总量]。

5.3色谱条件

（a）色谱柱：C18色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

（b）流动相：详见3.17；

（c）流速：0.7 mL/min；

（d）进样量：20 μL；

（e）柱温：25 ℃；

（f）检测器及波长：紫外-可见光检测器，检测波长为245nm。

6 实验结果

6.1重复性测试

按照上述色谱条件（5.3）进行采集，抗坏血酸混合标准工作液（浓度均为1.0μg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

图1抗坏血酸混合标准溶液的色谱图

表1抗坏血酸混合标准溶液色谱图积分结果

由表1中数据可知，L（+）-抗坏血酸的理论塔板数为10816，D（-）-抗坏血酸的理论塔板数为11070，L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸的分离度为1.83，可实现基线分离。

将抗坏血酸混合标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

图2抗坏血酸混合标准溶液连续进样7针叠加的色谱图

表2抗坏血酸混合标准溶液连续进样7针重复性数据统计

将混合标准溶液连续进样7针进行重复性测试，L（+）-抗坏血酸保留时间的RSD为0.203%，峰面积的RSD为0.501%；D（-）-抗坏血酸保留时间的RSD为0.222%，峰面积的RSD为0.300%。均具有良好的定性定量重复性。

6.2仪器灵敏度测试

灵敏度测试的谱图如图3所示，计算结果见表3。

图3仪器灵敏度的色谱图

表3仪器灵敏度测试数据

由表3中数据可知，L（+）-抗坏血酸的仪器检出限为0.015μg/mL，仪器定量限为0.049μg/mL；D（-）-抗坏血酸的仪器检出限为0.017μg/mL，仪器定量限为0.056μg/mL。

6.3含量测定

6.3.1校准曲线

按照色谱条件（5.3），将抗坏血酸标准系列工作液（3.16）上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数如图4~图5所示。由图4~图5可知，L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R2均在0.999以上。抗坏血酸系列标准工作液叠加的色谱图如图6所示。

图4L（+）-抗坏血酸的校准曲线

图5D（-）-抗坏血酸的校准曲线

图6抗坏血酸系列标准工作液叠加的色谱图

6.3.2试样溶液的测定

以乳粉作为试样，按照流程（5.1~5.2）对其进行处理，并进行加标回收实验。

依据公式（1）计算乳粉中L（+）-抗坏血酸[或D（-）-抗坏血酸]的含量和L（+）-抗坏血酸总量。

式中：X---试样中L（+）-抗坏血酸[或D（-）-抗坏血酸的含量、L（+）-抗坏血酸总量]的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；

C1----样液中L（+）-抗坏血酸[或D（-）-抗坏血酸]的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

C0----样液空白液中L（+）-抗坏血酸[或D（-）-抗坏血酸]的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V----试样的最后定容体积，单位为毫升（mL）；

m----实际检测试样质量，单位为克（g）；

1000----换算系数（由μg/mL换算成mg/mL的换算因子）；

F----稀释倍数（若使用6.3还原步骤时，即为2.5）；

100----换算系数（由mg/mL换算成mg/100g的换算因子）。

空白溶液的色谱图、乳粉试样的色谱图、乳粉试样还原后的色谱图、乳粉试样加标的色谱图、乳粉试样加标还原后的色谱图如图7~图11所示。

依据公式（1）计算乳粉试样中L（+）-抗坏血酸[或D（-）-抗坏血酸]的含量和L（+）-抗坏血酸总量，该乳粉试样中L（+）-抗坏血酸的含量为61mg/100g，D（-）-抗坏血酸未检出，L（+）-抗坏血酸总量为59mg/100g，抗坏血酸的加标回收率范围为75.2%~81.2%。

四、结论

通过对抗坏血酸的分离度、重复性、灵敏度、线性的测试以及对乳粉试样中抗坏血酸的含量及加标进行测定，实验结果表明：L（+）-抗坏血酸的理论塔板数为10816，D（-）-抗坏血酸的理论塔板数为11070，L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸的分离度为1.83，可实现良好的分离；重复性测试中，抗坏血酸混合标准溶液连续进样7针，L（+）-抗坏血酸保留时间的RSD为0.203%，峰面积的RSD为0.501%；D（-）-抗坏血酸保留时间的RSD为0.222%，峰面积的RSD为0.300%，均具有良好的定性定量重复性；L（+）-抗坏血酸的仪器检出限为0.015μg/mL，仪器定量限为0.049μg/mL；D（-）-抗坏血酸的仪器检出限为0.017μg/mL，仪器定量限为0.056μg/mL；L（+）-抗坏血酸和D（-）-抗坏血酸在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R2均在0.999以上；对乳粉试样进行测定，L（+）-抗坏血酸的含量为0.610mg/g，D（-）-抗坏血酸未检出，L（+）-抗坏血酸总量为59mg/100g，抗坏血酸的加标回收率范围为75.2%~81.2%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪满足《GB 5009.86-2016 食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定（第一法）》乳粉中抗坏血酸含量测定的需求。

附1：仪器配置清单

附2：悟空Wooking  K2025高效液相色谱仪（可靠、精准、友好、合规）