一、 摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定饲料中含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）的含量。首先将饲料中的含硫氨基酸用过甲酸溶液水解为磺基丙氨酸和蛋氨酸，再通过异氰酸苯酯将其衍生为带紫外吸收的衍生物后，采用反相色谱法进行测定，色谱条件：C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为40℃，进样量为10μL，检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为254nm。实验结果：磺基丙氨酸的理论塔板数为15275，拖尾因子为0.99；蛋氨酸砜的理论塔板数为245479，拖尾因子为0.87；混合标准溶液连续进样7针，磺基丙氨酸保留时间的RSD为0.296%，峰面积的RSD为0.543%；蛋氨酸砜保留时间的RSD为0.045%，峰面积的RSD为0.533%；磺基丙氨酸的仪器检出限为0.103µg/mL，仪器定量限为0.345µg/mL；蛋氨酸砜的仪器检出限为0.022µg/mL，仪器定量限为0.073µg/mL；磺基丙氨酸和蛋氨酸砜在测定浓度范围内，曲线的确定系数R2均大于0.999；饲料试样测试中，豆粕试样中胱氨酸和蛋氨酸的含量分别为0.59%和0.65%，平行样间的偏差分别为0.89%和1.93%；葵饼试样中胱氨酸和蛋氨酸的含量分别为0.52%和0.70%，平行样间的偏差分别为1.78%和1.48%；加标回收实验中，胱氨酸的回收率范围为93.7%~94.7%，蛋氨酸的回收率范围为99.0%~101.1%。

二、 背景

饲料中的含硫氨基酸包含蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。蛋氨酸也叫甲硫氨酸，是必需氨基酸，而胱氨酸和半胱氨酸是非必需氨基酸。含硫氨基酸在酸水解条件下容易被破坏。饲料中的含硫氨基酸是畜禽生长的必需氨基酸，了解饲料中其含量，以便合理地配制畜禽日粮。

植物性饲料是畜禽饲料中来源最丰富、用量最多的饲料，其中包括豆粕和葵饼。

三、 实验过程

1 范围

适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中含硫氨基酸的含量测定。

2 原理

饲料中的含硫氨基酸用过甲酸氧化和盐酸溶液水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，采用异硫氰酸苯酯衍生剂与生成的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜进行衍生反应，衍生物在254nm处有紫外吸收，经反相色谱柱分离后，紫外-可见光检测器检测，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2 30%过氧化氢：优级纯；

3.3 甲酸：色谱纯；

3.4 苯酚：ACS级；

3.5 过甲酸溶液：30%过氧化氢（3.2）+甲酸（3.3）=1+9，混合，并按每毫升添加5mg的比例加入苯酚（3.4），于室温下放置1h，置冰水浴中冷却30min，临用现配；

3.6 氢溴酸：优级纯；

3.7 浓盐酸：分析纯；

3.8 盐酸溶液（6mol/L）：量取盐酸（3.7）500mL，用水稀释至1000mL，混匀；

3.9 乙腈：色谱纯；

3.10 三乙胺：色谱纯；

3.11 三乙胺-乙腈溶液：移取1.40mL三乙胺（3.10）至10mL容量瓶中，用乙腈（3.9）定容至刻度，混匀；

3.12 异硫氰酸苯酯：色谱纯；

3.13 异硫氰酸苯酯-乙腈溶液：移取0.12mL异硫氰酸苯酯（3.12）至10mL容量瓶中，用乙腈（3.9）定容至刻度，混匀；

3.14 冰乙酸：优级纯；

3.15 20%（体积比）乙酸溶液：取2mL冰乙酸（3.14）至10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀；

3.16 正己烷：色谱纯；

3.17 80%乙腈水溶液：取800mL乙腈（3.9）和200mL水，混匀；

3.18 无水乙酸钠：优级纯；

3.19 乙酸钠缓冲液：称取1.64g无水乙酸钠（3.18），加适量水溶解，再加入0.5mL三乙胺（3.10），用水定容至1000mL，用20%乙酸溶液（3.15）调节pH至6.20，用滤膜过滤，超声备用；

3.20 磺基丙氨酸标准品：CAS号为498-40-8，纯度为99.3%；

3.21 蛋氨酸砜标准品：CAS号为7314-32-1，纯度为99.9%。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 高速万能粉碎机；

4.3 分析天平：精确到0.0001g；

4.4 鸡心瓶：50mL；

4.5 烧杯：250mL；

4.6 水解管：25mL；

4.7 涡旋混合器；

4.8 电热鼓风恒温箱：温度可达110℃±2℃；

4.9 旋转蒸发仪：可在室温至85℃间调温，控温精度±1℃；

4.10 pH计；

4.11 抽滤装置；

4.12 超声波清洗机；

4.13 具塞塑料离心管：5mL；

4.14 一次性针头注射器；

4.15 微孔滤膜：0.22µm，水相；

4.16 微孔滤膜：0.22µm，有机相；

4.17 容量瓶：10mL、50mL、1000mL，棕色带刻度。

5 测定步骤

5.1 标准溶液配制

5.1.1标准储备液配制

分别准确称取磺基丙氨酸标准品（3.20）4.7mg和蛋氨酸砜标准品（3.21）5.1mg，置于5mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，得到磺基丙氨酸和蛋氨酸砜浓度分别为933.420µg/mL和1018.980µg/mL的标准储备液。

5.1.2混合标准系列工作液配制

分别吸取上述标准储备液（5.1.1）各适量，用水稀释，配制成混合标准系列工作液，其中磺基丙氨酸浓度依次为0.933µg/mL、4.667µg/mL、9.334µg/mL、18.668µg/mL、46.671µg/mL和93.342µg/mL，蛋氨酸砜浓度依次为1.019µg/mL、5.095µg/mL、10.190µg/mL、20.380µg/mL、50.949µg/mL和101.898µg/mL。其中，磺基丙氨酸和蛋氨酸砜浓度分别为18.668µg/mL和20.380µg/mL的溶液作为混合标准溶液。

5.2 试样前处理

5.2.1试样准备

将饲料试样混匀后，用粉碎机粉碎，置于自封袋中，避光备用。

5.2.2试样水解溶液制备

平行做两份试样。称取试样50mg~75mg (约含蛋白质7.5mg~25mg，精确至0.1mg)，置于50mL鸡心瓶（4.4）中，于冰水浴中冷却30min后加入已冷却的过甲酸溶液（3.5）2mL，加液时需将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一道置于0℃~4℃冰箱中，反应16h。

从冰箱中取出上述反应后的鸡心瓶，加入0.3mL氢溴酸（3.6），振摇，放回冰浴，静置30min，然后移到旋转蒸发仪（4.9）上，于60℃下浓缩至干（以将液体旋出为准，注意观察，避免一开始沸腾造成试液损失）。

用盐酸溶液（3.8）约15mL将残渣定量转移到25mL水解管（4.6）中，旋紧管盖。将水解管置于110℃±2℃恒温箱（4.8）中，水解24h。取出水解管，冷却，用水将内容物定量转移至50mL容量瓶中，定容。充分混匀，用0.22µm微孔水相滤膜（4.15）过滤，此溶液作为供试品原液；取4mL滤液，置于旋转蒸发仪（4.9）中，在低于50℃下减压蒸发至干（以将液体旋出为准，注意观察，避免一开始沸腾造成试液损失）。加少许水，重复蒸干3次。加入少量水复溶，转移至5mL离心管（4.13）中，重复洗涤三次，最后用水定容至5mL，混匀，备用。

同时做空白试验，操作步骤同上。

5.2.3加标回收溶液制备

吸取5.2.2中供试品原液4mL至鸡心瓶（4.4）中，加入磺基丙氨酸储备液和蛋氨酸砜储备液（5.1.1）各80μL，混匀后置于旋转蒸发仪（4.9）中，在低于50℃下减压蒸发至干（以将液体旋出为准，注意观察，避免一开始沸腾造成试液损失）。加少许水，重复蒸干3次。加入少量水复溶，转移至5mL离心管（4.13）中，重复洗涤三次，最后用水定容至5mL，混匀，备用。

5.2.4 衍生

准确吸取试液（5.2.2和5.2.3）0.5mL于5mL离心管（4.13）中，依次加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液（3.13）250µL、三乙胺-乙腈溶液（3.11）250µL，混匀后室温下避光反应1h，加入50µL 20%乙酸溶液（3.15），混匀后加入1.0mL正己烷（3.16），涡旋混合器振荡1min，静置分层后，弃去上层正己烷，用针头注射器（4.14）小心吸取下层溶液，过0.22μm有机相滤膜（4.16）后供高效液相色谱仪测定。

5.3 混合标准系列工作液衍生

准确吸取上述配制好的混合标准系列工作液（5.1.2）各0.5mL，置于5mL离心管（4.13）中，按5.2.4中步骤进行衍生。

5.4色谱条件

a）色谱柱：C18色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：以80%乙腈水溶液（3.17）为流动相A，乙酸钠缓冲液（3.19）为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

c）进样量：10μL；

d）柱温：40℃；

e）检测器及波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为254nm。

6 结果

6.1 重复性测试

按照上述色谱条件（5.4）进行采集，混合标准溶液（磺基丙氨酸和蛋氨酸砜浓度分别为18.668µg/mL和20.380µg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

图1 混合标准溶液的色谱图

表1 混合标准溶液积分结果

由表1中数据可知，磺基丙氨酸的理论塔板数为15275，拖尾因子为0.99；蛋氨酸砜的理论塔板数为245479，拖尾因子为0.87，均具有良好的峰形。 

将混合标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

 

图2 混合标准溶液连续进样7针叠加的色谱图

表2 混合标准溶液连续进样7针重复性数据统计

由表2中数据可知，混合标准溶液连续进样7针，磺基丙氨酸保留时间的RSD为0.296%，峰面积的RSD为0.543%；蛋氨酸砜保留时间的RSD为0.045%，峰面积的RSD为0.533%，均具有良好的定性定量重复性。

6.2 仪器灵敏度测试

灵敏度测试的色谱图如图3所示，计算结果见表3。

 

图3仪器灵敏度的色谱图

表3仪器灵敏度测试数据

由表3中数据可知，磺基丙氨酸的仪器检出限为0.103µg/mL，仪器定量限为0.345µg/mL；蛋氨酸砜的仪器检出限为0.022µg/mL，仪器定量限为0.073µg/mL。

6.3 含量测定

6.3.1 校准曲线

将衍生后的混合标准系列工作液（5.1.2）在HPLC上进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程及确定系数见图4~图5，叠加色谱图见图6。磺基丙氨酸和蛋氨酸砜在测定浓度范围内，曲线的确定系数R2均大于0.999，线性关系均良好。

6.3.2 含量测定

将饲料试样（豆粕和葵饼）按照5.2.1~5.2.4的流程进行处理，按照公式（1）计算试样中含硫氨基酸的含量。

式中：ω----为试样中胱氨酸/蛋氨酸的含量，以其质量分数计（%）；

C----为通过校准曲线得到的测试液中磺基丙氨酸/蛋氨酸砜的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V----为测试液体积，单位为毫升（mL）；

f-----为稀释倍数；

M----为胱氨酸/蛋氨酸的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol，胱氨酸实为胱氨酸和半胱氨酸之和，以胱氨酸计；其中M胱氨酸=120.16，M蛋氨酸=149.21）；

m----为称样量，单位为克（g）；

Mst-----为磺基丙氨酸/蛋氨酸砜的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol，其中M磺基丙氨酸=169.16，M蛋氨酸砜=181.21）；

100、106----为单位换算系数。

空白试液的色谱图、试样的色谱图及试样加标的色谱图如图7~图11所示，试样中含硫氨基酸的含量见表4~表5。

 

图7 空白试液的色谱图

 

图8 豆粕试样的色谱图

 

图9 豆粕试样加标的色谱图

表4 豆粕试样中含硫氨基酸含量结果表

由表4中数据可知，豆粕试样中胱氨酸的含量为0.59%，平行样间的偏差为0.89%；蛋氨酸的含量为0.65%，平行样间的偏差为1.93%，均满足《GB/T 15399-2018 饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法》中在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算数平均值的差值，当含量大于0.5%时，不超过4%的要求；胱氨酸和蛋氨酸的加标回收率分别为93.7%和99.0%。

 

图10 葵饼试样的色谱图

 

图11 葵饼试样加标的色谱图

表5葵饼试样中含硫氨基酸含量结果表

由表5中数据可知，葵饼试样中胱氨酸的含量为0.52%，平行样间的偏差为1.78%；蛋氨酸的含量为0.70%，平行样间的偏差为1.48%，均满足《GB/T 15399-2018 饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法》中在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算数平均值的差值，当含量大于0.5%时，不超过4%的要求；胱氨酸和蛋氨酸的加标回收率分别为94.7%和101.1%。

四、 结论

本报告对饲料中还原水解后的含硫氨基酸经异硫氰酸苯酯衍生，采用反相色谱法，对其衍生物的峰形、重复性、灵敏度和线性进行测定，并测定饲料试样中含硫氨基酸的含量，实验结果表明：磺基丙氨酸的理论塔板数为15275，拖尾因子为0.99；蛋氨酸砜的理论塔板数为245479，拖尾因子为0.87，均具有良好的峰形；混合标准溶液连续进样7针，磺基丙氨酸保留时间的RSD为0.296%，峰面积的RSD为0.543%；蛋氨酸砜保留时间的RSD为0.045%，峰面积的RSD为0.533%，均具有良好的定性定量重复性；磺基丙氨酸的仪器检出限为0.103µg/mL，仪器定量限为0.345µg/mL；蛋氨酸砜的仪器检出限为0.022µg/mL，仪器定量限为0.073µg/mL；磺基丙氨酸和蛋氨酸砜在测定浓度范围内，曲线的确定系数R2均大于0.999，线性关系均良好；饲料试样测试中，豆粕试样中胱氨酸和蛋氨酸的含量分别为0.59%和0.65%，平行样间的偏差分别为0.89%和1.93%；葵饼试样中胱氨酸和蛋氨酸的含量分别为0.52%和0.70%，平行样间的偏差分别为1.78%和1.48%，均满足《GB/T 15399-2018 饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法》中在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算数平均值的差值，当含量大于0.5%时，不超过4%的要求；加标回收实验中，胱氨酸的回收率范围为93.7%~94.7%，蛋氨酸的回收率范围为99.0%~101.1%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可用于饲料中含硫氨基酸的含量测定。

附1：仪器配置清单