一、 摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定苦杏仁中苦杏仁苷的含量。色谱条件：色谱柱为C₁₈ 色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL，检测波长为207nm。实验结果：苦杏仁苷的理论塔板数为9572；苦杏仁苷标准溶液连续进样7针，保留时间的RSD为0.130%，峰面积的RSD为0.709%；苦杏仁苷在测定浓度范围内具有良好的线性关系（R²=0.9997）；苦杏仁苷的仪器检出限为0.271μg/mL，仪器定量限为0.904μg/mL，满足《中国药典（2020年版）》中使用高效液相色谱法测定苦杏仁中苦杏仁苷含量的要求。

二、 背景

苦杏仁为蔷薇科植物山杏、西伯利亚杏、东北杏或杏的干燥成熟种子。夏季采收成熟果实，除去果肉和核壳，取出种子，晒干。

苦杏仁的功能有降气止咳平喘，润肠通便，主治咳嗽气喘，胸满痰多，肠燥便秘。

三、 实验过程

1 范围

适用于苦杏仁中苦杏仁苷含量的测定。

2 原理

苦杏仁样品中的苦杏仁苷经甲醇超声提取后，采用HPLC反相色谱柱分离，使用紫外检测器检测，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T6682的一级水；

3.2 乙腈：色谱纯； 

3.3 磷酸：色谱纯；

3.4 甲醇：色谱纯；

3.5 甲醇溶液（50%）：吸取500mL的甲醇于1000mL的容量瓶中，用水稀释至刻度；

3.6 苦杏仁苷标准品：CAS号：29883-15-6，纯度为98.6%；

3.7 苦杏仁苷标准储备液：称取适量的苦杏仁苷标准品（3.6）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释配成浓度为1.090mg/mL的标准储备液；

3.8 苦杏仁苷标准工作液：分别吸取适量的苦杏仁苷标准储备液（3.7）至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度依次为5.350μg/mL、10.700μg/mL、21.400μg/mL、42.800μg/mL、53.500μg/mL和64.200µg/mL的系列标准工作溶液；

3.9 微孔滤膜：0.22µm，有机相。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 分析天平：精确到0.0001g；

4.3 涡旋振荡器；

4.4 超声波清洗机；

4.5 具塞锥形瓶：100mL；

4.6 定量滤纸；

4.7 容量瓶：10mL、50mL、1000mL，棕色带刻度。

5 测定步骤

5.1 样品处理

取苦杏仁约0.25g，精密称定，置于具塞锥形瓶（4.5）中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶液（3.5）稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5.2 色谱条件

a）色谱柱：C₁₈ 色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：乙腈：0.1%磷酸溶液=8:92；

c）柱温：25℃；

d）进样量：10μL；

e）流速：1.0mL/min；

f）检测器及波长：紫外检测器，检测波长为207nm。

6 结果

6.1 重复性测试

按照上述色谱条件（5.2）进行采集，苦杏仁苷标准溶液（浓度为42.800µg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

图1苦杏仁苷标准溶液的色谱图

表1 苦杏仁苷标准溶液色谱图积分结果

由表1中数据可知，苦杏仁苷的理论塔板数为9572，拖尾因子为0.91，满足《中国药典（2020年版）》中规定的理论塔板数按苦杏仁苷峰计算应不低于7000的要求。 

将苦杏仁苷标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

 

图2苦杏仁苷标准溶液连续进样7针叠加的色谱图

 

表2苦杏仁苷标准溶液连续进样7针重复性数据统计

由表2中数据可知，苦杏仁苷标准溶液连续进样7针，保留时间的RSD为0.130%，峰面积的RSD为0.709%，具有良好的定性定量重复性。

6.2 仪器灵敏度测试

灵敏度测试的谱图如图3所示，计算结果见表3。

 

图3仪器灵敏度的色谱图

 

表3仪器灵敏度测试数据

由表3中数据可知，苦杏仁苷的仪器检出限为0.271µg/mL，仪器定量限为0.904µg/mL。

6.3 含量测定

6.3.1 校准曲线

将配制好的苦杏仁苷标准工作液（3.8）在HPLC上进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程及相关系数见图4，叠加色谱图见图5。苦杏仁苷在测定浓度范围内，曲线的确定系数R²达到0.9997，线性关系良好。

 

图4苦杏仁苷标准溶液的校准曲线

 

图5苦杏仁苷标准溶液浓度系列叠加色谱图

6.3.2 样品含量测定

选择苦杏仁作为样品，按照5.1的流程对其进行处理。依据公式（1）进行计算，样品的色谱图如图6所示。

式中：X----为苦杏仁样品中苦杏仁苷的含量，单位为百分数（%）；

C----为通过校准曲线计算的样品中苦杏仁苷的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V----为样品的定容体积，单位为毫升（mL）；

m----为样品的质量，单位为克（g）；

100、10⁶----为单位换算系数。

 

图6苦杏仁样品的色谱图

 

依据公式（1）进行计算，此苦杏仁样品中苦杏仁苷的含量为3.9%。

四、结论

通过对苦杏仁苷的理论塔板数、重复性、灵敏度、线性的测定以及对苦杏仁样品的测试，实验结果表明：用Wooking K2025 高效液相色谱仪测定苦杏仁苷，苦杏仁苷的理论塔板数为9572，拖尾因子为0.91，满足《中国药典（2020年版）》中规定的理论塔板数按苦杏仁苷峰计应不低于7000的要求；苦杏仁苷标准溶液连续进样7针，保留时间的RSD为0.130%，峰面积的RSD为0.709%，具有良好的定性定量重复性；苦杏仁苷在测定浓度范围内具有良好的线性关系（R²=0.9997）；苦杏仁苷的仪器检出限为0.271μg/mL，仪器定量限为0.904μg/mL。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪满足《中国药典（2020年版）》中对苦杏仁中苦杏仁苷含量测定的要求。