应用说明：单克隆抗体分析

 

使用悟空HPCE-512毛细管电泳仪免标记内成像技术分析单克隆抗体

  

摘要

对单克隆抗体英夫利昔单抗和利妥昔单抗进行了免标记内成像分析，以评估其稳定性、碎裂性、电荷异质性和重复性。这项工作是作为英国国家卫生服务（NHS）研究的一部分进行的。在热应激前后观察到可量化的差异。峰面积相对标准差（RSD）为2.88%，峰迁移时间RSD为2.28%，具有优异的重现性。

简介

为了评价重组单克隆抗体（mAbs）作为生物药物的生物活性和安全性，必须对其进行全面的表征。这一信息不仅对评估潜在生物制药产品的适用性至关重要，而且对优化生产工艺、储存条件和药物在使用现场的寿命评估也很重要。

单克隆抗体利妥昔单抗和英夫利昔单抗是用于治疗关节炎以及许多其他炎性和自身免疫性疾病的生物药物。这些药物通常在几个小时内作为盐水注射。现行的NHS方案规定，一旦输液重新配制，必须在24小时内给药或丢弃。盐水输液中残留的药物也会被丢弃。这导致了药物的大量浪费，并导致了高昂的治疗费用。测试药物在重组后是否仍然具有安全使用的能力将防止浪费，并为国民保健服务带来显著的成本节约。该技术也完全适用于mAb生产工艺的上游。

本应用描述了悟空的高效毛细管电泳平台HPCE-512如何用于测定mAbs的裂解、稳定性、保存期和翻译后修饰。这些参数可用于评估生物药物在储存和重组后的使用是否安全。

材料和方法

毛细管凝胶电泳（CGE）

将mAb样品在CGE样品缓冲液中稀释至0.5mg/mL，并在还原和非还原条件下运行。还原后的样品用β-巯基乙醇处理并在70℃下加热10min。将未还原的样品在70℃下加热10min，不使用还原剂。

在内径为50μm，分离长度为20cm，总长度为32.4cm的裸石英毛细管内，用含有十二烷基硫酸钠（SDS）的CGE缓冲液进行毛细管电泳（CE）分离。所有样品在10psi下动态注射10s，在16kV（反极性）下分离45min。分离过程中，毛细管保持在22°C，检测波长为214nm。在实验开始和两次运行之间，使用专有方法对毛细管进行调节。

毛细管区带电泳（CZE）

将mAb样品在去离子水中稀释至0.2mg/mL，并在内径50μm，分离长度为40cm，总长度为52.4cm的裸石英毛细管中，使用专用CZE缓冲液进行CE分离。所有样品在0.5psi下进行流体动力学注射10s，并在24kV（标准极性）下分离45min。分离过程中，毛细管保持在25°C，样品转盘保持在20°C，检测波长为214nm。在实验开始和两次运行之间，使用专有方法对毛细管进行调节。

结果与讨论

CGE-利妥昔单抗参比样品与试验样品的比较

利妥昔单抗样品在还原和非还原条件下运行。对参比（原液）样品和试验（重组盐水输液产品）样品进行了比较。减少样本会破坏抗体重链和轻链之间的二硫键，导致两条链分离。发现测试样品中的峰面积减小，表明可能发生了一些样品降解（图1）。校正峰面积和百分比面积的比较如表1所示。结果表明，与对照样品相比，试验样品中轻链与重链的比例有所增加，这可能表明重链发生了一些降解。

 

图1 电泳图显示在还原条件下利妥昔单抗参考品和测试样品的分离。图上标出了轻链（L）和重链（H）。两个样本之间有明显的差异。展开图显示了参考样品中出现的、在原始图中没有出现的较小峰值。这些峰也出现在测试样品中，表明免标记信号处理的能力。如果不能解决所有出现的峰，特别是接近更大峰的小峰，就无法评估正确的产品质量。

 

表1 参比样品和试验样品的分子量、校正峰面积和%峰面积。

在非还原条件下，与对照样品相比，试验样品中完整抗体（峰7）的峰面积百分比（图2）降低，表明发生了低水平的降解。在测试样品中观察到一个额外的峰（峰8），其迁移速度比完整峰慢，这表明也存在某种程度的聚集。这些结果表明，mAb在重组后有细微的变化，这可能有助于改变药物的疗效和效力。

CGE-碎片分析

在还原性和非还原性条件下（图3），对因在40℃下长期储存而被迫降解的参考（输液浓缩液）样品进行分析。与图1和图2中的参考样品相比，降解后观察到峰的数量显著增加。

 

 

图3  电泳图谱显示，在40℃下贮存的力妥昔单抗参考样品的分离力随预期的增加而增加。如果需要，软件可以为所有峰值生成面积的百分数（表3）。

 

表3 利妥昔单抗参考样品的峰面积百分比，在40°C储存时已被降解。

CZE-英夫利昔单抗电荷异质性的翻译后修饰分析

以不同浓度制备的英夫利昔单抗样品在2~8℃作为对照，或在40℃胁迫条件下保存，用CZE方法评价其差异。在测试的温度参数下，对照样品和应力样品之间存在显著差异。将1.07mg/mL的英夫利昔单抗分成两个等分试样，一个试样储存在4~8°C，一个存储在40°C（图4）。观察到电荷分布的明显差异，应力样品显示出酸性变异体的增加以及峰面积的整体减少。这一分析表明了在不适当的温度下储存所引起的翻译后修饰的差异。

 

 

CZE-重现性

通过在0.2mg/mL浓度下对英夫利昔单抗对照样品进行6次重复注射来评估重现性（图5），得到峰面积的相对标准差（RSDs）为2.88%，出峰时间的相对标准差（RSDs）为2.28%。

 

图5 6个重复注射0.2mg/mL英夫利昔单抗对照样品的电泳图

结论

本应用提供的数据表明，悟空HPCE-512毛细管电泳平台能够使用单一分析工具对单克隆抗体药物产品进行完整的表征。使用CGE和CZE技术在热应激样品中观察到可量化的差异，从而评估样品的稳定性，以确定是否适合给药给患者。

实验得到了良好的重现性，峰面积的相对标准差（RSDs）为2.88%，峰迁移时间的相对标准差（RSDs）为2.28%。

 

单克隆抗体分析

对单克隆抗体英夫利昔单抗和利妥昔单抗进行稳定性、碎裂、电荷异质性和重复性的评估。这项工作是作为英国国家卫生服务（NHS）研究的一部分进行的。在同样受到热应激的样品中观察到可量化的差异。

本应用提供的数据表明，悟空HPCE-512毛细管电泳平台能够使用单一分析工具对单克隆抗体药物产品进行完整的表征。使用CGE和CZE技术在热应激样品中观察到可量化的差异，从而评估样品对患者的适用性。

实验得到了良好的重现性，峰面积的相对标准差（RSDs）为2.88%，峰迁移时间的相对标准差（RSDs）为2.28%。