一、摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定木贼中山奈酚的含量。色谱条件：C₁₈色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL，检测波长为365nm。实验结果：山奈酚峰的理论塔板数为16783，拖尾因子为1.13；在连续进样7针的重复性测试中，山奈酚保留时间的RSD为0.210%，峰面积的RSD为0.237%；山奈酚的仪器检出限为0.013μg/mL，仪器定量限为0.042μg/mL；对木贼样品进行测定，木贼中山奈酚的含量为0.10%，加标回收率为100.5%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《中国药典（2020年版）》一部中木贼中山奈酚含量测定的需求。

二、背景

木贼呈长管状，不分枝，长40-60cm，直径0.2-0.7cm；表面为灰绿色或黄绿色，有18-30条纵棱，棱上有多数细小光亮的疣状突起，节明显，节间长2.5-9cm，节上着生筒状鳞叶，叶鞘基部和鞘齿黑棕色，中部淡棕黄色，体轻，质脆，易折断，断面中空，周边有多数圆形的小空腔，气微，味甘淡、微涩，嚼之有沙粒感。

山柰酚属于黄酮类化合物，为黄色结晶性粉末，微溶于水，溶于热乙醇、乙醚或碱溶液，主要有抗菌、抗炎、止咳祛痰的作用。

三、实验过程

1 范围

适用于木贼中山奈酚的含量测定。

2原理

木贼中的山奈酚经75%甲醇溶液加热回流提取，盐酸加热水解后，在365nm处有紫外吸收，使用高效液相色谱法测定，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2甲醇：色谱纯；

3.3 盐酸：分析纯；

3.4 75%甲醇溶液：取750mL甲醇（3.2），加水定容至1L；

3.5 山奈酚对照品：CAS号：520-18-3，纯度：99.2%；

3.6 乙腈：色谱纯；

3.7 磷酸：色谱纯；

3.8 0.4%磷酸溶液：精密量取磷酸（3.7）4mL，用水定容至1L；

3.9 流动相：乙腈：0.4%磷酸溶液（3.8）=50：50；

3.10 市售木贼饮片样品。

4 仪器与设备

4.1高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2分析天平：精确到0.0001g；

4.3 超声波清洗机；

4.4涡旋振荡器；

4.5容量瓶：10mL、50mL，棕色带刻度；

4.6具塞锥形瓶：100mL；

4.7加热回流装置；

4.8恒温水浴装置；

4.9 0.22μm微孔滤膜，有机相。

5 测定步骤

5.1 标准溶液的配制

5.1.1 山奈酚标准储备液：取山奈酚对照品（3.5）适量，用75%甲醇溶液（3.4）溶解，配制成山奈酚浓度为1.0mg/mL的标准储备液。

5.1.2 山奈酚标准系列工作液：分别取山奈酚标准储备液（5.1.1）适量，用75%甲醇溶液（3.4）配制成浓度分别为2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的标准系列工作液。

5.2 供试品溶液的制备

取经粉碎的木贼样品约0.75g，精密称定，置于具塞锥形瓶（4.6）中，精密加入75%甲醇溶液（3.4）50mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用75%甲醇溶液（3.4）补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20mL，加盐酸(3.3)5mL，置于水浴（4.8）中加热水解1小时，放冷，转移至50mL容量瓶中，加入75%甲醇溶液（3.4）至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5.3色谱条件

a）色谱柱：C₁₈，4.6×250mm，5µm或者相当的色谱柱；

b）流动相：详见3.9；

c）流速：1.0mL/min；

d）进样量：10μL；

e）柱温：30℃；

f）检测器及波长：紫外-可见光检测器，检测波长为365nm。

6 实验结果

6.1 重复性测试

按照上述色谱条件（5.3）进行采集，山奈酚标准溶液（浓度为20μg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

图1 山奈酚标准溶液的色谱图

表1 山奈酚标准溶液色谱图积分结果

由表1中数据可知，山奈酚峰的理论塔板数为16783，满足《中国药典（2020年版）》一部中理论塔板数按山奈酚峰计算应不小于3000的要求；拖尾因子为1.13，具有良好的峰形。

将山奈酚标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

图2 山奈酚标准溶液叠加的色谱图

表2 山奈酚标准溶液连续进样7针重复性数据统计

将山奈酚标准溶液连续进样7针进行重复性测试，山奈酚保留时间的RSD为0.210%，峰面积的RSD为0.237%，具有良好的定性定量重复性。

6.2仪器灵敏度测试

灵敏度测试的色谱图如图3所示，计算结果见表3。

图3 仪器灵敏度的色谱图

表3 仪器灵敏度测试数据

通过计算，山奈酚的仪器检出限为0.013μg/mL，仪器定量限为0.042μg/mL。

6.3含量测定

6.3.1 校准曲线

按照上述色谱条件（5.3）进行采集，将山奈酚标准系列工作液（5.1.2）上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数如图4所示。

图4山奈酚的校准曲线

由图4可知，山奈酚在测定浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R²在0.999以上。山奈酚标准系列工作液叠加的色谱图如图5所示。

图5山奈酚标准工作液叠加色谱图

6.3.2含量测定

按照步骤5.2对市售木贼样品进行处理。依据公式（1）进行计算，木贼样品及木贼样品加标的色谱图如图6~图7所示。

式中：ω----为木贼试样中山奈酚的含量，单位为百分数（%）；

C----为通过校准曲线得到的试样中山奈酚的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V----为试样的定容体积，单位为毫升（mL）；

f----为试样的稀释倍数；

m----为试样的质量，单位为克（g）；

10⁶和100----为换算系数。

图6 木贼样品的色谱图

图7 木贼样品加标的色谱图

由公式（1）计算木贼样品中山奈酚的含量，该样品中山奈酚的含量为0.10%，加标回收率为100.5%。

四、结论

通过对山奈酚的理论塔板数、重复性、灵敏度的测定以及对木贼中山奈酚含量进行测定，实验结果表明：山奈酚峰的理论塔板数为16783，满足《中国药典（2020年版）》一部中理论塔板数按山奈酚峰计算应不小于3000的要求；拖尾因子为1.13，具有良好的峰形；在重复性测试中，山奈酚保留时间的RSD为0.210%，峰面积的RSD为0.237%，具有良好的定性定量重复性；山奈酚的仪器检出限为0.013μg/mL，仪器定量限为0.042μg/mL；对木贼样品进行测定，该样品中山奈酚的含量为0.10%，加标回收率为100.5%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《中国药典（2020年版）》一部中木贼中山奈酚含量测定的需求。

附1：仪器配置清单