一、 摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定饲料中五种磺胺类药物的含量。色谱条件：C₁₈色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为40℃，进样量为20μL，检测器为紫外检测器，检测波长为270nm。实验结果：重复性测试中，将磺胺类药物混合标准溶液连续进样7针，保留时间的RSD范围为0.000%~0.040%，峰面积的RSD范围为0.061%~0.201%；磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉的仪器检出限均不大于0.010μg/mL，仪器定量限均不大于0.034μg/mL；五种磺胺类药物在测定浓度范围内均具有良好的线性关系（R²≥0.9999）。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪满足《GB/T 19542-2007 饲料中磺胺类药物的测定 高效液相色谱法》中五种磺胺类药物含量测定的需求。

二、 背景

磺胺类药物为人工合成的抗菌药，用于临床已近50年，它具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简便、生产时不耗用粮食等优点。磺胺类药物在养殖临床用药过程的实用性强，对许多革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌、诺卡氏菌属、衣原体属和某些原虫（如疟原虫和阿米巴原虫）均有抑制作用。

三、 实验过程

1 范围

适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混饲料中磺胺类药物（磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉）的含量测定。

2 原理

试样中磺胺类药物经乙腈振荡提取后，用碱性氧化铝小柱净化，注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫外检测器检测，外标法计算磺胺类药物的含量。

3 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T6682的一级水；

3.2 甲醇：色谱纯；

3.3 乙腈：色谱纯；

3.4 冰乙酸：优级纯；

3.5 流动相：在1000mL容量瓶中加入800mL水，移取冰乙酸（3.4）3mL置于水中，再与200mL乙腈（3.3）混合，摇匀，过0.22µm滤膜，脱气，备用；

3.6 磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉混合标准溶液：浓度为100µg/mL；

3.7 五种磺胺类药物系列混合标准工作液：将五种磺胺类药物混合标准溶液（3.6）用甲醇稀释并定容配制成混合标准工作液，磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉五种磺胺类药物系列浓度依次为1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL和20.00μg/mL；

3.8 微孔滤膜：0.22µm，有机系；

3.9 碱性氧化铝SPE小柱；1000mg/12mL、120Å。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025UVD紫外检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 分析天平：精确到0.0001g；

4.3 固相萃取仪；

4.4 涡旋振荡器；

4.5 具塞锥形瓶：150mL；

4.6 容量瓶：50mL、1000mL，棕色带刻度。

5 测定步骤

5.1 样品前处理

5.1.1提取

称取2g（精确至0.0001g）饲料试样于150mL具塞锥形瓶（4.5）中，加入50mL乙腈（3.3），于振荡器（4.4）中振荡提取30min，过滤，滤液备用；

5.1.2净化

准确吸取上述试样溶液2mL，移入用10mL乙腈淋洗过的碱性氧化铝小柱（3.9）中，使其自然流出，待试样溶液全部流出后，吹干，用两次2mL流动相（3.5）洗脱，收集洗脱液，过0.22µm的滤膜，续滤液待上机测定。

5.2 色谱条件

a）色谱柱：C₁₈色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：见3.5：

c）流速：1.0mL/min；

d）进样量：20μL；

e）柱温：40℃；

f）检测器及波长：紫外检测器，检测波长为270nm。

6 结果

6.1 重复性测试

按照上述色谱条件（5.2）进行采集，五种磺胺类药物混合标准溶液（磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉的浓度均为10µg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

图1五种磺胺类药物混合标准溶液的色谱图

表1 五种磺胺类药物混合标准溶液积分结果

 

由表1中数据可知，五种磺胺类药物的分离度均大于1.5，可以达到基线分离；五种磺胺类药物的拖尾因子均小于1.2，具有良好的峰型。 

 

将五种磺胺类药物混合标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

 

图2 五种磺胺类药物混合标准溶液连续进样7针叠加的色谱图

表2五种磺胺类药物混合标准溶液连续进样7针重复性数据统计

由表2中数据可知，五种磺胺类药物混合标准溶液连续进样7针，其中磺胺嘧啶保留时间的RSD为0.040%，峰面积的RSD为0.061%；磺胺间甲氧嘧啶保留时间的RSD为0.000%，峰面积的RSD为0.141%；磺胺二甲基嘧啶保留时间的RSD为0.000%，峰面积的RSD为0.148%；磺胺甲恶唑保留时间的RSD为0.018%，峰面积的RSD为0.088%；磺胺喹恶啉保留时间的RSD为0.019%，峰面积的RSD为0.201%，均具有良好的定性定量重复性。

6.2 仪器灵敏度测试

灵敏度测试的色谱图如图3所示，计算结果见表3。

 

图3仪器灵敏度的色谱图

 

 

 

 

 

 

表3仪器灵敏度测试数据

 

由表3中数据可知，磺胺嘧啶的仪器检出限为0.0030μg/mL，仪器定量限为0.010μg/mL；磺胺间甲氧嘧啶的仪器检出限为0.0037μg/mL，仪器定量限为0.012μg/mL；磺胺二甲基嘧啶的仪器检出限为0.0047μg/mL，仪器定量限为0.016μg/mL；磺胺甲恶唑的仪器检出限为0.0099μg/mL，仪器定量限为0.033μg/mL；磺胺喹恶啉的仪器检出限0.010μg/mL，仪器定量限为0.034μg/mL。

6.3 含量测定

6.3.1 校准曲线

将配制好的五种磺胺类药物系列混合标准工作液（3.7）在HPLC上进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程及确定系数见图4~图8，叠加色谱图见图9。五种磺胺类药物在测定浓度范围内，曲线的确定系数R²均大于0.9999，线性关系均良好。

 

图5 磺胺间甲氧嘧啶系列标准溶液的校准曲线

 

 

 

图7磺胺甲恶唑系列标准溶液的校准曲线

 

图9五种磺胺类药物混合标准溶液浓度系列曲线叠加色谱图

6.3.2 样品含量测定

以市售预混饲料为样品，按照5.1的流程对样品进行处理，并计算样品中五种磺胺类药物的含量。按照公式（1）进行计算，样品的色谱图如图10，样品加标的色谱图如图11所示。

式中：ω----为每种磺胺类药物（分别为磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉）的含量， 单位为毫克每千克(mg/kg)；

C----为通过校准曲线计算的样品中每种磺胺类药物的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V----为样品的定容体积，单位为毫升(mL)；

m----为样品质量，单位为克(g)；

f-----为稀释倍数；

1000----为单位换算系数。

 

图10 预混饲料样品的色谱图

 

图11 预混饲料样品加标的色谱图

依据公式（1）进行计算，此预混饲料样品中五种磺胺类药物的含量均为未检出，磺胺嘧啶的回收率为100.1%，磺胺间甲氧嘧啶的回收率为100.2%，磺胺二甲基嘧啶的回收率为100.5%，磺胺甲恶唑的回收率为101.0%，磺胺喹恶啉的回收率为101.9%。

四、 结论

通过对五种磺胺类药物的分离度、峰型、重复性、灵敏度、线性的测试以及对预混饲料样品中五种磺胺类药物的含量进行测定，实验结果：用K2025测定饲料中五种磺胺类药物，五种磺胺类药物相邻两峰之间的分离度均大于1.5，均可实现良好的分离；五种磺胺类药物色谱峰的对称因子均小于1.2，均具有良好的峰型；重复性测试中，五种磺胺类药物混合标准溶液连续进样7针，五种磺胺类药物保留时间的RSD范围为0.000%~0.040%，峰面积的RSD范围为0.061%~0.201%，均有良好的定性定量重复性；磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉的仪器检出限均不大于0.010μg/mL，仪器定量限均不大于0.034μg/mL；在测定浓度范围内，五种磺胺类药物均具有良好的线性关系，确定系数R²均大于0.9999；此预混饲料中这五种磺胺类药物均未检出，磺胺嘧啶的回收率为100.1%，磺胺间甲氧嘧啶的回收率为100.2%，磺胺二甲基嘧啶的回收率为100.5%，磺胺甲恶唑的回收率为101.0%，磺胺喹恶啉的回收率为101.9%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《GB/T 19542-2007 饲料中磺胺类药物的测定 高效液相色谱法》中五种磺胺类药物含量测定的需求。

附1：仪器配置清单