一、 摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定木薯叶片中黄酮醇的含量。色谱条件：C₁₈色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为0.8mL/min，柱温为40℃，进样量为10μL，检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为360nm。实验结果：杨梅苷、芦丁、烟花苷与水仙苷的理论塔板数范围为71176~93182，拖尾因子范围为0.94~1.14；连续进样7针重复性测试，杨梅苷、芦丁、烟花苷与水仙苷保留时间的RSD范围为0.092%~0.100%，峰面积的RSD范围为0.436%~0.658%；杨梅苷、芦丁、烟花苷与水仙苷的仪器检出限范围为0.004μg/mL~0.045μg/mL，仪器定量限范围为0.013μg/mL~0.151μg/mL；杨梅苷、芦丁、烟花苷及水仙苷在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R²在0.999以上；两次平行测试中，杨梅苷的含量分别为4.4mg/kg、3.8mg/kg，芦丁的含量分别为9.8×10³mg/kg、8.7×10³mg/kg，烟花苷的含量分别为7.2×10³mg/kg、6.4×10³mg/kg，水仙苷的含量为112.1mg/kg、120.4mg/kg，相对偏差范围为3.58%~7.50%。 

二、 背景

木薯别名为树葛，大戟科木薯属植物，被称为淀粉之王。木薯叶中不仅含有丰富的类胡萝卜素，黄酮类物质含量也很高。黄酮类化合物具有自由基的清除、抗氧化活力增强的作用。

三、 实验过程

1 范围

适用于木薯干叶中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷的含量测定。

2 原理

木薯叶片试样中加入50%乙醇水溶液，经超声波辅助提取，高效液相色谱仪分离，紫外-可见光检测器检测，根据保留时间定性，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2 甲醇：色谱纯；

3.3 无水乙醇：色谱纯；

3.4 磷酸：色谱纯；

3.5 50%乙醇水溶液：取50mL无水乙醇（3.3），加入50mL水（3.1），混匀；

3.6 0.2%磷酸水溶液：取2mL磷酸（3.4），置于1000mL容量瓶中，用水（3.1）定容至刻度；

3.7 杨梅苷标准品：CAS号为17912-87-7，纯度≥99%；

3.8 芦丁标准品：CAS号为153-18-4，纯度为99.0%；

3.9 烟花苷标准品：CAS号为17650-84-9，纯度≥98%；

3.10 水仙苷标准品：CAS号为604-80-8，纯度≥98%。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 分析天平：精确到0.0001g；

4.3 涡旋振荡器；

4.4 粉碎机；

4.5 0.2mm筛；

4.6 超声波清洗机；

4.7 抽滤装置；

4.8 离心机：转速大于2000r/min；

4.9 离心管：15mL；

4.10 移液器：100μL，1000μL；

4.11 容量瓶：10mL，1000mL，棕色带刻度；

4.12 微孔滤膜：0.22μm，有机相。

5 测定步骤

5.1 标准溶液配制

5.1.1 标准储备液

称取杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷标准品（3.7~3.10）分别为1.1mg、5.8mg、3.5mg和1.1mg，加甲醇（3.2）溶解并定容至1mL，配制成质量浓度分别为1.1mg/mL、5.8mg/mL、3.5mg/mL和1.1mg/mL的标准储备液，于-18℃密封避光保存。

5.1.2 混合标准中间工作液

分别移取1.0mL杨梅苷、芦丁、烟花苷、水仙苷标准储备液（5.1.1）于10mL棕色容量瓶中，用50%乙醇水溶液（3.5）稀释并定容，配制成4种黄酮醇质量浓度分别为110.0μg/mL、580.0μg/mL、350.0μg/mL、110.0μg/mL的混合标准中间工作液，现用现配。

5.1.3 黄酮醇系列混合标准工作液

准确移取适量的混合标准中间工作液（5.1.2），用50%乙醇水溶液（3.5）逐级稀释，配制成杨梅苷质量浓度依次为0.28μg/mL、0.55μg/mL、2.75μg/mL、5.50μg/mL、27.50μg/mL、55.00μg/mL、110.00μg/mL，芦丁质量浓度依次为0.15μg/mL、2.90μg/mL、14.50μg/mL、29.00μg/mL、145.00μg/mL、290.00μg/mL、580.00μg/mL，烟花苷质量浓度依次为0.18μg/mL、1.75μg/mL、8.75μg/mL、17.50μg/mL、87.50μg/mL、175.00μg/mL、350.00μg/mL，水仙苷质量浓度依次为0.28μg/mL、0.55μg/mL、2.75μg/mL、5.50μg/mL、27.50μg/mL、55.00μg/mL、110.00μg/mL的系列混合标准工作液。现用现配。

5.2 样品制备与提取

5.2.1 木薯干叶粉末制备

取适量的木薯干叶（不带叶柄），用粉碎机研磨至粉末，过0.2mm筛，混匀，装入洁净的密封袋中，8℃下密封避光保存。

5.2.2 提取

分别准确称取木薯干叶粉末（5.2.1）各0.2g（±0.0002g）于15mL离心管中，标记为木薯叶平行试样1、木薯叶平行试样2，加入50%乙醇水溶液（3.5）5.0mL，旋涡振荡混匀，超声提取60min（50℃，500W），离心10min（4200r/min，25℃），上清液转移至10mL容量瓶中，残渣再加入50%乙醇水溶液（3.5）5.0mL，旋涡振荡混匀，离心5min（10000r/min，25℃），合并两次离心的上清液，加入50%乙醇水溶液（3.5）定容至10mL，旋涡振荡混匀，取该溶液1mL，过0.22μm微孔滤膜，收集续滤液待上机测定。

5.3 色谱条件

a）色谱柱： C₁₈色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：以甲醇（3.2）为流动相A，0.2%磷酸水溶液（3.6）为流动相B；按下表进行梯度洗脱：

c）流速：0.8mL/min；

d）进样量：10μL；

e）柱温：40℃；

f）检测器及波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为360nm。

6 结果

6.1 重复性测试

按照上述色谱条件（5.3）进行采集，混合标准溶液（杨梅苷浓度为2.75μg/mL、芦丁浓度为14.50μg/mL、烟花苷浓度为8.75μg/mL、水仙苷浓度为2.75μg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

图1混合标准溶液的色谱图

表1 混合标准溶液色谱图积分结果

由表1中数据可知，杨梅苷的理论塔板数为71176，拖尾因子为1.14；芦丁的理论塔板数为77767，拖尾因子为1.12；烟花苷的理论塔板数为93182，拖尾因子为1.12；水仙苷的理论塔板数为82282，拖尾因子为0.94，皆具有良好的峰形。

将混合标准溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

 

图2 混合标准溶液连续进样7针叠加的色谱图

表2 混合标准溶液连续进样7针重复性数据统计

 

由表2中数据可知，混合标准溶液连续进样7针重复性测试，杨梅苷保留时间的RSD为0.100%，峰面积的RSD为0.658%；芦丁保留时间的RSD为0.096%，峰面积的RSD为0.461%；烟花苷保留时间的RSD为0.094%，峰面积的RSD为0.436%；水仙苷保留时间的RSD为0.092%，峰面积的RSD为0.541%，皆具有良好的定性定量重复性。

6.2 仪器灵敏度测试

灵敏度测试的色谱图如图3所示，计算结果见表3。

 

图3 仪器灵敏度的色谱图

表3仪器灵敏度测试数据

 

由表3中数据可知，杨梅苷的仪器检出限为0.045μg/mL，仪器定量限为0.151μg/mL；芦丁的仪器检出限为0.004μg/mL，仪器定量限为0.013μg/mL；烟花苷的仪器检出限为0.012μg/mL，仪器定量限为0.039μg/mL；水仙苷的仪器检出限为0.037μg/mL，仪器定量限为0.123μg/mL。

6.3 含量测定

6.3.1校准曲线

 按照上述色谱条件（5.3）进行采集，将黄酮醇系列混合标准工作液（5.1.3）上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数如图4~7所示。由图4~图7可知，杨梅苷、芦丁、烟花苷及水仙苷在测定浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R²在0.999以上。黄酮醇系列混合标准工作液叠加的色谱图如图8所示。

图4杨梅苷的校准曲线

 

图5芦丁的校准曲线

图6烟花苷的校准曲线

图7水仙苷的校准曲线

 

图8黄酮醇系列混合标准工作液叠加色谱图

6.3.2含量测定

按照步骤5.2对木薯叶进行处理。依据公式（1）进行计算，空白溶液的色谱图、木薯叶平行试样1、木薯叶平行试样2的色谱图如图9~图11所示。

式中：X_i----为试样中杨梅苷/芦丁/烟花苷/水仙苷的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

ρ_i----为从标准工作曲线得到的试样溶液中各组分的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V----为试样提取液定容体积，单位为毫升（mL）；

m----为试样质量，单位为克（g）；

f----为稀释倍数；

1000----为换算系数。

 

图9空白溶液的色谱图

 

图10 木薯叶平行试样1的色谱图

 

图11 木薯叶平行试样2的色谱图

依据公式（1）计算木薯试样中黄酮醇的含量，两次平行测试中，杨梅苷的含量分别为4.4mg/kg、3.8mg/kg，相对偏差为7.50%；芦丁的含量分别为9.8×10³mg/kg、8.7×10³mg/kg，相对偏差为5.75%；烟花苷的含量分别为7.2×10³mg/kg、6.4×10³mg/kg，相对偏差为5.79%；水仙苷的含量为112.1mg/kg、120.4mg/kg，相对偏差为3.58%，满足《GB/T 42114-2022 木薯叶片中黄酮醇的测定 高效液相色谱法》中规定的两次测定结果的相对偏差不大于10%的要求。

7 结论

通过对杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷的理论塔板数、重复性、灵敏度、线性的测试以及对木薯叶片中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷的含量进行测定，实验结果表明：杨梅苷、芦丁、烟花苷与水仙苷的理论塔板数范围为71176~93182，拖尾因子范围为0.94~1.14，皆具有良好的峰形；连续进样7针重复性测试，杨梅苷、芦丁、烟花苷与水仙苷保留时间的RSD范围为0.092%~0.100%，峰面积的RSD范围为0.436%~0.658%，皆具有良好的定性定量重复性；杨梅苷、芦丁、烟花苷与水仙苷的仪器检出限范围为0.004μg/mL~0.045μg/mL，仪器定量限范围为0.013μg/mL~0.151μg/mL；杨梅苷、芦丁、烟花苷及水仙苷在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R²在0.999以上；两次平行测试中，杨梅苷的含量分别为4.4mg/kg、3.8mg/kg，芦丁的含量分别为9.8×10³mg/kg、8.7×10³mg/kg，烟花苷的含量分别为7.2×10³mg/kg、6.4×10³mg/kg，水仙苷的含量为112.1mg/kg、120.4mg/kg，相对偏差范围为3.58%~7.50%，满足《GB/T 42114-2022 木薯叶片中黄酮醇的测定 高效液相色谱法》中规定的两次测定结果的相对偏差不大于10%的要求。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《GB/T 42114-2022 木薯叶片中黄酮醇的测定 高效液相色谱法》中对木薯叶片中黄酮醇含量测定的需求。

附1：仪器配置清单

附2：悟空Wooking  K2025高效液相色谱仪（可靠、精准、友好、合规）