一、摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定头孢克洛的有关物质。色谱条件：C₁₈色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为20μL，检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为220nm。实验结果：头孢克洛峰的保留时间为23.742min；头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度为10.92；头孢克洛峰的拖尾因子为0.96；峰面积小于对照溶液主峰面积0.5倍且大于对照溶液主峰面积0.1倍的杂质峰共有10个，且各杂质含量在0.11%~0.29%之间，总杂的含量为1.76%；对照溶液连续进样7针重复性测试中，头孢克洛保留时间的RSD为0.099%，峰面积的RSD为0.083%；头孢克洛灵敏度溶液的信噪比S/N为101.7。

二、背景

头孢克洛化学名为（6R，7R）-7-［（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基］-3-氯-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环［4.2.0］辛-2-烯-2-甲酸一水合物，为白色至微黄色粉末或结晶性粉末，微臭；在水中微溶，在甲醇、乙醇或二氯甲烷中几乎不溶。

三、实验过程

1 范围

适用于头孢克洛有关物质的测定。

2原理

头孢克洛及其有关物质在220nm处有紫外吸收，使用高效液相色谱法测定。

3 试剂与材料

3.1水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2磷酸二氢钠：分析纯；

3.3磷酸：色谱纯；

3.4 0.27%磷酸二氢钠溶液（pH=2.5）：称取磷酸二氢钠（3.2）0.27g，加少量水溶解后加水至100mL，用磷酸（3.3）调节pH值至2.5，摇匀；

3.5 流动相A：0.78%磷酸二氢钠溶液（pH=4.0）：称取磷酸二氢钠（3.2）7.8g，加少量水溶解后加水至1000mL，用磷酸（3.3）调节pH值至4.0，摇匀；

3.6 乙腈：色谱纯；

3.7流动相B：乙腈（3.6）-0.78%磷酸二氢钠溶液（pH=4.0）（3.5）=45∶55；

3.8头孢克洛对照品；

3.9头孢克洛δ-3-异构体对照品；

3.10头孢克洛试验用样品。                                                                

4 仪器与设备

4.1高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2分析天平：精确到0.0001g；

4.3 涡旋振荡器；

4.4超声波清洗机；

4.5 pH计；

4.6容量瓶：10mL、100mL、1000mL，棕色带刻度。

5 测定步骤

5.1 溶液配制

系统适用性溶液：取头孢克洛对照品（3.8）和头孢克洛δ-3-异构体对照品（3.9）各适量，加0.27%磷酸二氢钠溶液（pH=2.5）（3.4）溶解并稀释制成每1mL中各约含25μg和50μg的混合溶液；

供试品溶液：取本品约50mg，置于10mL容量瓶中，加0.27%磷酸二氢钠溶液（pH=2.5）（3.4）溶解并稀释至刻度，摇匀；

对照溶液：精密量取供试品溶液1mL，置于100mL容量瓶中，用0.27%磷酸二氢钠溶液（pH=2.5）（3.4）稀释至刻度，摇匀；

灵敏度溶液：供试品溶液用0.27%磷酸二氢钠溶液（pH=2.5）（3.4）稀释2000倍。

5.2色谱条件

a）色谱柱：C₁₈色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）以0.78%磷酸二氢钠溶液（3.5）为流动相A，以乙腈（3.6）-0.78%磷酸二氢钠溶液（pH=4.0）（3.5）=45∶55为流动相B（3.7），按照下表进行梯度洗脱：

 

c）流速：1.0mL/min；

d）柱温：35℃；

e）检测器及波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为220nm；

f）进样量：20μL。

6 系统适用性要求

系统适用性溶液色谱图中，头孢克洛峰的保留时间约为23分钟，头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度应不小于2.0，头孢克洛峰的拖尾因子应小于1.2。

7 限度

供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍（2%），小于对照溶液主峰面积0.1倍的峰忽略不计。

8实验结果

按照上述色谱条件（5.2）进行采集，系统适用性溶液的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

由表1中数据可知，头孢克洛峰的保留时间为23.742min，满足《中国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰的保留时间约为23分钟的要求；头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度为10.92，满足《中国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度应不小于2.0的要求；头孢克洛峰的拖尾因子为0.96，满足《中国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰的拖尾因子应小于1.2的要求。

供试品溶液的色谱图如图2所示，积分结果如表2所示。

 

 

 

图2供试品溶液的色谱图

表2供试品溶液色谱图积分结果

 

对色谱图中主峰及各个杂质峰进行积分，依据公式（1）计算各杂质的含量。

由表2中数据可知，峰面积小于对照溶液主峰面积0.5倍且大于对照溶液主峰面积0.1倍的杂质峰共有10个，且各杂质含量在0.11%~0.29%之间；总杂的含量为1.76%，不大于限度2%。

对照溶液的色谱图如图3所示。

 

图3对照溶液的色谱图

将对照溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图4所示，统计结果见表3。

 

图4对照溶液连续进样7针叠加的色谱图

表3对照溶液连续进样7针重复性数据统计

 由表3中数据可知，对照溶液连续进样7针重复性测试，头孢克洛保留时间的RSD为0.099%，峰面积的RSD为0.083%，具有良好的定性定量重复性。

灵敏度溶液的色谱图如图5所示，灵敏度计算结果见表4。

 

图5 仪器灵敏度的色谱图

 

由表4中数据可知，头孢克洛灵敏度溶液的信噪比S/N为101.7。

9 结论

通过对系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液和灵敏度溶液进行测定，实验结果表明：头孢克洛峰的保留时间为23.742min，满足《中国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰的保留时间约为23分钟的要求；头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度为10.92，满足《中国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度应不小于2.0的要求；头孢克洛峰的拖尾因子为0.96，满足《中国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰的拖尾因子应小于1.2的要求；峰面积小于对照溶液主峰面积0.5倍且大于对照溶液主峰面积0.1倍的杂质峰共有10个，且各杂质的含量在0.11%~0.29%之间；总杂的含量为1.76%，不大于限度2%；对照溶液连续进样7针重复性测试中，头孢克洛保留时间的RSD为0.099%，峰面积的RSD为0.083%，具有良好的定性定量重复性；头孢克洛灵敏度溶液的信噪比S/N为101.7。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪对头孢克洛有关物质的测定，在出峰时间、分离度及拖尾因子等方面均满足《中国药典（2020年版）二部》的要求。