阿奇霉素含量的测定 高效液相色谱法
2023-06-16
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一、摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定阿奇霉素的含量。色谱条件:C18色谱柱(4.6×250mm5μm),流速为1.0mL/min,柱温为30℃,进样量为50μL,检测波长为210nm。实验结果:阿奇霉素峰的理论塔板数为13412,满足《中国药典(2020年版)》中规定的理论塔板数按阿奇霉素峰计算不低于3000的要求;在连续进样7针的重复性测试中,阿奇霉素峰保留时间的RSD为0.148%,峰面积的RSD为0.376%;阿奇霉素的仪器检出限为0.570μg/mL,仪器定量限为1.898μg/mL;阿奇霉素在测定浓度范围内具有良好的线性关系(R20. 9999)。对供试品进行测定,供试品中阿奇霉素的含量为101.2%。因此,Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《中国药典(2020年版)》中阿奇霉素含量测定的需求。

二、背景

本品为白色至类白色结晶性粉末;无臭;微有引湿性;在甲醇、丙酮、无水乙醇或稀盐酸中易溶,在乙腈中溶解,在水中几乎不溶。由《中国药典(2020年版)二部》所收录,为抗菌素药。

三、实验过程

1 范围

适用于阿奇霉素含量的测定。

2原理

阿奇霉素在210nm处有紫外吸收,使用高效液相色谱法测定,外标法定量。

3 试剂与材料

3.1水:符合GB/T6682的一级水;

3.2乙腈:色谱纯;

3.3 磷酸氢二钾:分析纯;

3.4 磷酸:色谱纯;

3.5 20%磷酸溶液:取10mL磷酸(3.4),用水定容至50mL;

3.6 流动相:磷酸氢二钾溶液(称取磷酸氢二钾(3.3)8.7g,加水至1000mL,用20%磷酸溶液(3.5)调节pH值至8.2)-乙腈(3.2=45:55

3.7 阿奇霉素对照品。

4 仪器与设备

4.1高效液相色谱仪:K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器Wookinglab色谱工作站;

4.2分析天平:精确到0.0001g;

4.3pH计:精确到0.01;

4.4真空抽滤装置;

4.5涡旋振荡器;

4.6 50mL容量瓶。

5 测定步骤

5.1 标准溶液的配制

5.1.1 阿奇霉素标准储备液:取阿奇霉素对照品(3.7)适量,加乙腈(3.2)溶解并定量稀释配制成每1mL中含1mg的溶液。

5.1.2 阿奇霉素系列标准工作液:分别取阿奇霉素标准储备液(5.1.1)适量,用乙腈(3.2)配制成阿奇霉素浓度依次为0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.50mg/mL1.0mg/mL的系列标准工作液。

5.2色谱条件

a)色谱柱: C184.6×250mm,5µm

b)流动相:详见3.6;

c)流速:1.0mL/min;

d)柱温:30℃;

e)检测器及波长:紫外-可见光检测器,检测波长为210nm;

f)进样量:50μL。

6 实验结果

6.1 重复性测试

按照上述色谱条件(5.2)进行采集,阿奇霉素标准溶液(浓度为0.20mg/mL)的色谱图如图1所示,积分结果如表1所示。

1 阿奇霉素标准溶液的色谱图

表1 阿奇霉素标准溶液色谱图积分结果

目标物

保留时间(min)

峰面积(mAU.s)

峰高(mAU)

理论塔板数

分离度

对称/拖尾因子

阿奇霉素

26.008

807.401

22.027

13412

-

2.08

由表1中数据可知,阿奇霉素峰的理论塔板数为13412。

将阿奇霉素标准溶液连续进样7针,叠加的色谱图如图2所示,结果见表2。

2 阿奇霉素标准溶液的色谱图

表2 阿奇霉素标准溶液连续进样7针重复性数据统计


将标准溶液连续进样7针进行重复性测试,阿奇霉素保留时间的RSD为0.148%,峰面积的RSD为0.376%,具有良好的定性定量重复性。

6.2仪器灵敏度测试

灵敏度测试的色谱图如图3所示,计算结果见表3。

3 仪器灵敏度的色谱图

表3 仪器灵敏度测试数据

目标物

浓度

mg/mL)

峰高

(mAU)

噪声(mAU)

S/N

LOD

μg/mL)

LOQ

μg/mL)

阿奇霉素

0.05

5.268

0.020

263.4

0.570

1.898

通过计算,阿奇霉素的仪器检出限为0.570μg/mL,仪器定量限为1.898μg/mL。

6.3含量测定

6.3.1 校准曲线

按照色谱条件(5.2),将阿奇霉素系列标准工作液(5.1.2)上机测定,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制校准曲线,线性方程和确定系数如图4所示。由图4可知,阿奇霉素在测定浓度范围内呈现良好的线性关系,确定系数R2>0.9999。阿奇霉素系列标准工作液叠加的色谱图如图5所示


4 阿奇霉素的校准曲线

5 阿奇霉素系列标准工作液叠加的色谱图

6.3.2 供试品测定

供试品溶液:取供试品适量,精密称定,加乙腈(3.2)溶解并定量稀释制成每1 mL中约含1mg的溶液。

按照步骤5.2对供试品溶液进行采集,依据公式(1)进行计算,空白溶液的色谱图、供试品溶液的色谱图如图6~图7所示。

式中:ω----为试样中阿奇霉素的含量,单位为百分数(%);

C----为通过校准曲线得到的供试品溶液中阿奇霉素的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

V----为试样的定容体积,单位为毫升(mL);

m----为试样的质量,单位为克(g);

103100----为换算系数。

6 空白溶液的色谱图

7 供试品溶液的色谱图

公式(1)计算供试品中阿奇霉素的含量,该供试品中阿奇霉素的含量为101.2%。

结论

通过对阿奇霉素的理论塔板数、重复性、灵敏度、线性进行测试,实验结果表明:阿奇霉素峰的理论塔板数为13412,满足《中国药典(2020年版)》中规定的理论塔板数按阿奇霉素峰计算不低于3000的要求;在重复性测试中,阿奇霉素标准溶液连续进样7针,保留时间的RSD为0.148%,峰面积的RSD为0.376%,具有良好的定性定量重复性;阿奇霉素的仪器检出限为0.570μg/mL,仪器定量限为1.898μg/mL;阿奇霉素在测定浓度范围内具有良好的线性关系(R20. 9999)。对供试品进行测定,供试品中阿奇霉素的含量为101.2%。因此,Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《中国药典(2020年版)》中阿奇霉素含量测定的需求。

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