叶酸属于维生素B复合体，是一种常见的水溶性维生素，因最早是从菠菜叶中提取纯化而得，所以被命名为叶酸。

叶酸具有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，同时参与不同酶系统中辅酶及嘌呤的合成，对DNA和RNA的合成十分重要。作为一种重要的营养素，在不同生理阶段补给叶酸，能够改善机体的生长性能和免疫机能，对动物机体的许多生理功能产生促进作用。

饲料中添加叶酸对维持母猪的繁殖性能和促进胚胎早期发育有着重要作用。研究表明，母猪日粮添加饲料级叶酸可提高胚胎存活率，稳定提高窝产仔数。

实验部分：

预混饲料中叶酸的含量测定高效液相色谱法

【仪器与试剂】

仪器与设备：悟空K2025高效液相色谱仪；分析天平（精确到0.0001g）；涡旋振荡器；

超声波清洗机；离心机；容量瓶（100mL、1000mL，棕色带刻度）。

试剂与材料：符合GB/T6682的一级水；甲醇(色谱级)；冰乙酸(优级纯)；庚烷磺酸钠(色谱纯)；三乙胺(优级纯)；无水碳酸钠；0.45 μm滤膜；叶酸标准品(含量≥95.0%)。

【样品前处理】

称取试样0.5 g（精确到0.001 g），置于100 mL棕色容量瓶中，加入约70 mL水、4 mL 2 mol/L碳酸钠溶液，置于超声水浴中超声提取10 min，期间摇动2次；待冷却后加水至约95 mL，再次检查试样溶液pH值，确认pH值为8～9，否则滴加少量碳酸钠溶液调节；用水定容至刻度，摇匀。取部分试液离心5 min，取上清液过滤，待上机测定。

【色谱条件】

a）色谱柱: C18  4.6×150mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：称取1.1g庚烷磺酸钠、50 mg EDTA溶于约1000 mL水中，加入20 mL冰乙酸、5 mL三乙胺混匀，用冰乙酸、三乙胺调节溶液pH值为4.0，过0.45 μm滤膜。取上述溶液800 mL与200 mL甲醇混合，备用；

c）柱温：25℃；

d）进样量：20μL；

e）流速：1.0 mL/min；

f）波长：282nm。

【结果与讨论】：

1. 叶酸标准溶液色谱图如图1所示：

图1叶酸标准溶液（5μg/mL）色谱图

2. 将叶酸标准溶液逐级稀释至信噪比S/N为3左右，计算仪器的检出限，数据结果见表1。经计算仪器针对叶酸的检出限为0.00939μg/mL，定量限为0.0313μg/mL。

表1灵敏度测试数据

3. 将系列叶酸标准溶液在HPLC上进行测定，绘制校准曲线，线性方程及相关系数见图2，曲线的相关系数为0.99999，线性关系良好。

图2叶酸标准溶液校准曲线

4. 购买市售的预混饲料作为样品进行处理，并进行加标回收实验，样品加标回收色谱图如图3；经计算，此市售预混饲料样品加标后叶酸含量为75.2 mg /kg，加标回收率为93.8%。

图3 市售预混饲料加标回收色谱图

【结论】

使用K2025高效液相色谱仪测定饲料中的叶酸含量具有良好的线性关系，确定系数R2为0.99999；连续进样7针，标准品保留时间的RSD为0.084%，峰面积RSD为0.117%，定性、定量均有良好的重复性；仪器检出限为0.00939μg/mL，定量限为0.0313μg/mL，完全满足标准《GB/T 17813-2018 添加剂预混合饲料中烟酸和叶酸的测定 高效液相色谱法》针对饲料中叶酸含量测定的需求。