维生素B1是一种常见的水溶性的维生素，参与机体内辅酶的形成，并且不能自行合成，必须要从外界获取。

维生素B1适用于维生素B1缺乏症，具有维持正常糖代谢及神经传导的功能，也用于消化不良、神经炎等的辅助治疗，对于机体的生理功能、新陈代谢有着非常重要的作用。

维生素作为各种关键酶部分，畜禽缺乏时，易产生碳水化合物代谢障碍，食欲减退，生长迟缓，消化道疾病及繁殖障碍等症状。

因此，在饲料中添加维生素B1能够有效的预防动物在生长发育过程中出现的上述症状。然而预混饲料中维生素B1含量的检测需要一个科学的实验方法，本次实验使用悟空Wooking K2025高效液相色谱仪对其进行检测。

实验部分

高效液相色谱法测定

预混饲料中维生素B1的含量

仪器与试剂

仪器与设备：

悟空Wooking K2025高效液相色谱仪，分析天平(精确到0.0001g)，容量瓶(10、100、1000mL，带刻度)，涡旋振荡器等；

悟空Wooking K2025高效液相色谱仪

试剂与材料：

符合GB/T6682的一级水；甲醇(色谱级)；冰乙酸(优级纯)；三乙胺(分析纯)；庚烷磺酸钠(优级纯)；二水合乙二胺四乙酸二钠(优级纯)；酸性乙醇溶液；维生素B1(硝酸硫胺素，纯度大于99%)。

实验方法

样品前处理：

称取试样0.25 g～0.5 g(精确到0.0001 g)，置于100 mL棕色容量瓶中，加入提取液约70 mL，边加边摇匀，置于超声水浴中超声提取15 min，期间摇动2次，冷却，用提取液定容至刻度，摇匀。取少量溶液于离心机上8000 r/min离心5 min，上清液过0.45μm微孔滤膜，待上机测定。

色谱条件

①色谱柱: C18 4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

②流动相：称取庚烷磺酸钠1.1g、EDTA 50mg于1000 mL容量瓶中，加入约1000 mL水，同时加入25 mL冰乙酸、约10mL三乙胺，超声使固体溶解，用pH计调节溶液pH为3.7，过0.45μm滤膜，取800mL该溶液，与200 mL甲醇混合；

③柱温：25℃；

④进样量：20μL；

⑤流速：1.0 mL/min；

⑥波长：242nm。

结果与讨论

1、按照上述色谱条件进行采集，维生素B1标准溶液的色谱图1如下：

图1 维生素B1标准溶液（5μg/mL）色谱图

2、将维生素B1标准溶液逐级稀释至信噪比S/N为3左右，计算仪器的检出限，数据结果见表1。经计算仪器针对维生素B1检出限为0.089μg/mL，定量限为0.296μg/mL。

表1 灵敏度测试数据

3、将维生素B1浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的标准曲线溶液在HPLC上进行测定，绘制校准曲线，线性方程及相关系数见图2，曲线的相关系数为0.9999，线性关系良好。

图2 维生素B1标准溶液校准曲线

4、购买市售的预混饲料作为样品进行处理，并根据样品含量对样品进行加标回收实验。

经计算，此市售的预混饲料样品中维生素B1的含量为769mg/kg，加标回收率为93%。

图3  市售预混饲料样品色谱图

图4  市售预混饲料加标回收实验色谱图

结果与讨论

通过对维生素B1线性、重复性、灵敏度的测试以及对市售预混饲料样品中维生素B1的含量进行测定。结果表明，使用悟空Wooking K2025高效液相色谱仪测定维生素B1线性关系良好，确定系数R2为0.9999；连续进样7针，标准品保留时间的RSD为0.060%，峰面积RSD为0.269%，定性、定量均有良好的重复性；仪器检出限为0.089μg/mL，定量限为0.296μg/mL完全满足饲料中维生素B1含量测定的需求。