应用说明

对映体-小分子，CZE

用悟空高效毛细管电泳（HPCE）的免标记内成像（LFII^®）技术分析对映体

使用悟空高效毛细管电泳Peregrine系统和专利LFII^®技术，成功地对碱性、中性和酸性药物中的四对对映体进行了分析和解决，证明该系统能够在峰迁移率（<0.1%RSD）和峰面积（<2.5%RSD）方面产生高质量的可重复数据。

此外，在99.9%的其他对映体存在下，能够检测到含量0.1%的杂质R或S阿替洛尔。

简介

在HPCE Peregrine系统上，使用悟空专有的免标记内成像（LFII^®）技术对四组不同的对映体进行了分析。分析时，在缓冲液中加入高硫酸化环糊精（HSCD）。这使得对映体的分离在恒定条件下进行。在低pH下，电渗流（EOF）被抑制，并且负电荷CDs向阳极迁移。因此，对映体通过此系统与HSCDs疏水空腔相互作用。在低pH时，碱性化合物是强阳离子，因此与带负电荷的CDs在疏水性和离子性上相互作用；而酸性化合物在低pH下质子化，因此只能作为具有疏水腔的中性物种。

由于HSCDs的高导电性，会产生高电流，因此分离在内径为25μm的裸石英毛细管中进行。有效的毛细管温度调节对于防止焦耳加热效应也非常重要。帕尔帖冷却系统使用精确的热设置。

采用毛细管区带电泳（CZE），分析了酮洛芬（酸性）、华法林（中性）、丙醇和阿替洛尔（碱性），证明了悟空HPCE Peregrine毛细管电泳平台的能力。

材料和方法

在内径为25μm、有效分离长度为22cm、总长度为32cm的裸石英毛细管中对对映体进行分离。带有Peregrine帕尔帖冷却系统设置为22°C。所有样品在运行缓冲液中制成，使用2 psi的压力，注射时间为2s。反极性电压模式下采用运行电压为15kV。电泳在含有适当HSCD的专用缓冲液中进行。该缓冲液在使用前需脱气。将样品稀释至25mM，调节磷酸缓冲液pH值为2.5。

在两次运行之间，用专用方法冲洗毛细管：先用无菌水冲洗1min，再冲洗毛细管2min，然后用运行缓冲液（包含合适浓度为5%）冲洗2min，最后检查连续性。所有数据均在214nm处采集。

结果

基于悟空HPCE Peregrine系统，利用等相位顶点算法（EVA）以及通用分离变换（GST）算法，对每对对映体进行快速有效地分离。GST是一种将512像素的数据以自然的方式组合起来的方法，它保留了像素的峰值形状信息，同时使信噪比最大化。我们观察到，与单一电泳图相比，使用GST使信噪比增加了10倍。

EVA是一种先进的模式识别工具，它最大化了系统的分辨率。定量信息是峰高而不是峰面积。在EVA中，首先分析电泳图以找到局部峰值。这些用于执行顶点（确定原点），然后产生信号输出。

每对对映体的单像素原始电泳图、GST和EVA处理数据如图所示，从左到右分别为酮洛芬（酸性）、丙醇（碱性）、华法林（中性）和阿替洛尔（基本），对应图依次为图1、图2、图3和图4。

图4 阿替洛尔单像素、GST和EVA数据的比较

使用悟空HPCE Peregrine的LFII^®系统证明了对映体的重现性。根据GST数据，峰迁移时间和峰面积计算重现性，分别如表1和表2所示。

表1 每对对映体峰迁移时间的GST重现性（基于峰1）

图5显示了对存在于阿替洛尔R对映体中微量的阿替洛尔S对映体的分析。基本药物中S-型占R-对映体的0.1%，而图6显示了R-型浓度（作为S-型的百分比）与观察到的峰面积百分比的关系图。

图5在R-阿替洛尔中含有0.1%S-阿替洛尔的GST和EVA图

图6在S-阿替洛尔中含有0.1%R-阿替洛尔的GST和EVA图

结论

具有LFII^®检测的悟空HPCE Peregrine系统已成功应用于手性分析，展示了对对映体的快速有效分离。卓越的分辨率在四组对映体之间进行了验证，具有较高的重现性。峰面积与浓度之间具有良好的线性关系，定量为0.1%的对映体是主要的存在形式。在运行缓冲液中加入适当的高硫酸化环糊精，可以解决多种对映体混合物，如酸性、中性和碱性药物的分析。

GST数据显示了令人印象深刻的信噪比的增加，以及对映体显著的分辨率，而EVA处理的数据显示了两个峰的分辨率的显著提高。

这证明了Peregrine系统对对映体强大的分离能力，特别是使用悟空的EVA信号分析数据时。