高效液相色谱法检测预混饲料中维生素B₁的含量
2021-10-22
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维生素B1是一种常见的水溶性的维生素,参与机体内辅酶的形成,并且不能自行合成,必须要从外界获取。

维生素B1适用于维生素B1缺乏症,具有维持正常糖代谢及神经传导的功能,也用于消化不良、神经炎等的辅助治疗,对于机体的生理功能、新陈代谢有着非常重要的作用。

维生素作为各种关键酶部分,畜禽缺乏时,易产生碳水化合物代谢障碍,食欲减退,生长迟缓,消化道疾病及繁殖障碍等症状。

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因此,在饲料中添加维生素B1能够有效的预防动物在生长发育过程中出现的上述症状。然而预混饲料中维生素B1含量的检测需要一个科学的实验方法,本次实验使用悟空Wooking K2025高效液相色谱仪对其进行检测。

实验部分

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高效液相色谱法测定

预混饲料中维生素B1的含量


仪器与试剂

仪器与设备:

悟空Wooking K2025高效液相色谱仪,分析天平(精确到0.0001g),容量瓶(10、100、1000mL,带刻度),涡旋振荡器等;

悟空Wooking K2025高效液相色谱仪

试剂与材料:

符合GB/T6682的一级水;甲醇(色谱级);冰乙酸(优级纯);三乙胺(分析纯);庚烷磺酸钠(优级纯);二水合乙二胺四乙酸二钠(优级纯);酸性乙醇溶液;维生素B1(硝酸硫胺素,纯度大于99%)。


实验方法

样品前处理:

称取试样0.25 g~0.5 g(精确到0.0001 g),置于100 mL棕色容量瓶中,加入提取液约70 mL,边加边摇匀,置于超声水浴中超声提取15 min,期间摇动2次,冷却,用提取液定容至刻度,摇匀。取少量溶液于离心机上8000 r/min离心5 min,上清液过0.45μm微孔滤膜,待上机测定。


色谱条件

①色谱柱: C18 4.6×250mm,5μm或者相当的色谱柱;

②流动相:称取庚烷磺酸钠1.1g、EDTA 50mg于1000 mL容量瓶中,加入约1000 mL水,同时加入25 mL冰乙酸、约10mL三乙胺,超声使固体溶解,用pH计调节溶液pH为3.7,过0.45μm滤膜,取800mL该溶液,与200 mL甲醇混合;

③柱温:25℃;

④进样量:20μL;

⑤流速:1.0 mL/min;

⑥波长:242nm。


结果与讨论

1、按照上述色谱条件进行采集,维生素B1标准溶液的色谱图1如下:

图1 维生素B1标准溶液(5μg/mL)色谱图


2、将维生素B1标准溶液逐级稀释至信噪比S/N为3左右,计算仪器的检出限,数据结果见表1。经计算仪器针对维生素B1检出限为0.089μg/mL,定量限为0.296μg/mL。

表1 灵敏度测试数据


3、将维生素B1浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的标准曲线溶液在HPLC上进行测定,绘制校准曲线,线性方程及相关系数见图2,曲线的相关系数为0.9999,线性关系良好。

图2 维生素B1标准溶液校准曲线


4、购买市售的预混饲料作为样品进行处理,并根据样品含量对样品进行加标回收实验。


经计算,此市售的预混饲料样品中维生素B1的含量为769mg/kg,加标回收率为93%。

图3  市售预混饲料样品色谱图

图4  市售预混饲料加标回收实验色谱图


结果与讨论

通过对维生素B1线性、重复性、灵敏度的测试以及对市售预混饲料样品中维生素B1的含量进行测定。结果表明,使用悟空Wooking K2025高效液相色谱仪测定维生素B1线性关系良好,确定系数R2为0.9999;连续进样7针,标准品保留时间的RSD为0.060%,峰面积RSD为0.269%,定性、定量均有良好的重复性;仪器检出限为0.089μg/mL,定量限为0.296μg/mL完全满足饲料中维生素B1含量测定的需求。


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